Akty Prawne
Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej - Seria L
Dz.U.UE.L.2001.225.1

Dyrektywa 2001/59/WE dostosowująca do postępu technicznego po raz dwudziesty ósmy dyrektywę Rady 67/548/EWG w sprawie zbliżenia przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych dotyczących klasyfikacji, pakowania i etykietowania substancji niebezpiecznych

DYREKTYWA KOMISJI 2001/59/WE

z dnia 6 sierpnia 2001 r.

dostosowująca do postępu technicznego po raz dwudziesty ósmy dyrektywę Rady 67/548/EWG w sprawie zbliżenia przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych dotyczących klasyfikacji, pakowania i etykietowania substancji niebezpiecznych

(Tekst mający znaczenie dla EOG)

(Dz.U.UE L z dnia 21 sierpnia 2001 r.)

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,

uwzględniając Traktat ustanawiający Wspólnotę Europejską,

uwzględniając dyrektywę Rady 67/548/EWG z dnia 27 czerwca 1967 r. w sprawie zbliżenia przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych dotyczących klasyfikacji, pakowania i etykietowania substancji niebezpiecznych ⁽¹⁾, ostatnio zmienioną dyrektywą Komisji 2000/33/WE ⁽²⁾, w szczególności jej art. 28,

a także mając na uwadze, co następuje:

(1) Załącznik I do dyrektywy 67/548/EWG zawiera wykaz substancji niebezpiecznych, wraz ze szczegółowymi danymi klasyfikacji i etykietowania każdej substancji. Obecna wiedza naukowa i techniczna wykazała, że wykaz substancji niebezpiecznych w tym załączniku powinien być dostosowany do postępu technicznego. W szczególności, tabela A i B we wstępie do załącznika I wymagają włączenia nomenklatury fińskiej i szwedzkiej. Niektóre wersje językowe dyrektywy wymagają poprawek technicznych we właściwych punktach wstępu do załącznika I. Użyteczne jest opublikowanie uaktualnionej i przepracowanej wersji wstępu do załącznika I. Ponadto wykaz sam w sobie powinien być uaktualniony, aby objąć zgłoszone nowe substancje oraz dalej istniejące substancje; identyfikacji, nomenklatura, klasyfikacja, etykietowanie i/lub granice stężeń w odniesieniu do niektórych substancji powinny być zmienione w celu odzwierciedlenia postępu wiedzy technicznej; pozycje dla trzech substancji powinny być skreślone z wykazu, gdyż zostały zastąpione przez inne pozycje.

(2) Załącznik II do dyrektywy 67/548/EWG zawiera wykaz symboli i oznaczeń niebezpieczeństwa w odniesieniu do substancji i preparatów niebezpiecznych. Załącznik III do dyrektywy 67/548/EWG zawiera wykaz sformułowań wskazujących na charakterystykę szczególnego ryzyka odnoszącego się do substancji i preparatów niebezpiecznych. Załącznik IV do dyrektywy 67/548/EWG zawiera wykaz sformułowań wskazujących zalecenia w zakresie bezpieczeństwa dotyczące substancji i preparatów niebezpiecznych. Załączniki II, III i IV wymagają włączenia fińskiego i szwedzkiego brzmienia. Niektóre wersje językowe dyrektywy wymagają technicznych poprawek we właściwych punktach załączników II, III i IV. Użyteczne jest opublikowanie uaktualnionych i przepracowanych wersji załączników II, III i IV.

(3) Art. 1 dyrektywy Parlamentu Europejskiego i Rady 1999/33/WE ⁽³⁾ zezwolił Szwecji od dnia 1 stycznia 1999 r. do dnia 31 grudnia 2000 r. na wymaganie użycia dodatkowego sformułowania R, R340, niewymienionego w załączniku III w odniesieniu do substancji sklasyfikowanych jako rakotwórcze, kategoria 3, zamiast sformułowania R, R40. Eksperci Państw Członkowskich uzgodnili poddanie przeglądowi tekstu zwrotu R, R40 w celu odniesienia do substancji rakotwórczych, kategorii 3. Nowe sformułowanie R, R68 powinno być dodane do załącznika III, zawierającego oryginalny tekst sformułowania R, R40 w odniesieniu do klasyfikacji i etykietowania substancji mutagennych kategorii 3 i substancji szkodliwych wymienionych w załączniku I. Odniesienia w zakresie klasyfikacji, etykietowania i granicy stężenia w załączniku I, zawierającym R40, powinny być zatem poddane przeglądowi w odniesieniu do takich substancji mutagennych kategorii 3 i substancji szkodliwych.

(4) Załącznik V do dyrektywy 67/548/EWG ustanawia metody określania właściwości fizykochemicznych, toksyczności i ekotoksyczności substancji i preparatów. Niezbędne jest dostosowanie tego załącznika do postępu technicznego. Właściwe jest ograniczenie do minimum liczby zwierząt wykorzystywanych do celów doświadczalnych, zgodnie z dyrektywą Rady 86/609/EWG ⁽⁴⁾. Rozdział B.1 powinien być zatem skreślony, ponieważ są dostępne metody alternatywne, z wykorzystaniem mniejszej liczby zwierząt. Należytą uwagę powinno poświęcić się metodom uznanym i zalecanym przez właściwe organizacje międzynarodowe. Metody podprzewlekłej toksyczności drogą pokarmową w rozdziałach B.26 i B.27 powinny być odpowiednio poddane przeglądowi, a rozdziały C.14 do C.20, dotyczące toksyczności dla środowiska naturalnego powinny być dodane do załącznika V. Niektóre wersje językowe wymagają technicznych poprawek we właściwych punktach załącznika V.

(5) Załącznik VI do dyrektywy 67/548/EWG zawiera wskazówki do klasyfikacji i etykietowania substancji i preparatów niebezpiecznych. Niezbędne jest dostosowanie tego załącznika do postępu technicznego. Niektóre wersje językowe dyrektywy wymagają technicznych poprawek we właściwych punktach załącznika VI. Właściwe punkty wymagają publikacji w językach fińskim i szwedzkim. Użyteczne jest opublikowanie uaktualnionej i przepracowanej wersji załącznika VI, w szczególności włączając odniesienie do dyrektywy 1999/45/WE Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 31 maja 1999 r. odnoszącej się do zbliżenia przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych Państw Członkowskich odnoszących się do klasyfikacji, pakowania i etykietowania preparatów niebezpiecznych ⁽⁵⁾.

(6) Zgodnie z przepisami dyrektywy 67/548/EWG wszelkie nowe substancje wprowadzane do obrotu powinny być zgłaszane właściwym władzom Państw Członkowskich za pomocą zawiadomienia zawierającego niektóre informacje, w tym dokumentację techniczną. W odniesieniu do nowych substancji dostarczanych i następnie zużywanych w reakcjach chemicznych, które podlegają ścisłej kontroli (półprodukty z ograniczoną ekspozycją) jest technicznie uzasadnione i stosowne określenie zredukowanego opakowania do badań. Bieżący postęp techniczny może zapewnić minimalne narażenie ludzi i środowiska naturalnego poprzez rygorystyczne powstrzymanie procesu.

(7) Dokumentacja techniczna musi zawierać opakowanie do badań dla półproduktów z ograniczoną ekspozycją, która musi dostarczać informacji niezbędnych do oceny przewidywanego zagrożenia dla ludzi i środowiska naturalnego. Załącznik VII powinien określić zawartość tej dokumentacji technicznej, a załącznik VIII powinien wyszczególniać dodatkowe badania i badania, które mogą być wymagane w odniesieniu do półproduktów z ograniczoną ekspozycją, wprowadzanych do obrotu w większej ilości.

(8) Kryteria zawiadamiania o półproduktach z ograniczoną ekspozycją mogą wymagać przeglądu w świetle postępu technicznego i doświadczenia uzyskanego w zakresie takich zawiadomień dokonanych zgodnie z nowymi szczególnymi wymaganiami ustanowionymi w niniejszej dyrektywie.

(9) Środki przewidziane w niniejszej dyrektywie są zgodne z opinią Komitetu ds. Dostosowania do Postępu Technicznego Dyrektyw w sprawie Zniesienia Barier Technicznych w Handlu Substancjami i Preparatami Niebezpiecznymi,

PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DYREKTYWĘ:

Artykuł 1

W dyrektywie 67/548/EWG wprowadza się następujące zmiany:

1. W załączniku I wprowadza się następujące zmiany:

a) tabele A i B we wstępie do załącznika I zawierają fińską i szwedzką nomenklaturę. Niektóre wersje językowe niniejszej dyrektywy muszą zawierać techniczne poprawki we właściwych punktach wstępu w tabelach A i B. Wstęp, włączając tabele A i B, zastępuje się załącznikiem 1A do niniejszej dyrektywy;

b) odpowiednie pozycje zastępuje się pozycjami w załączniku 1B do niniejszej dyrektywy;

c) dodaje się pozycje w załączniku 1C do niniejszej dyrektywy;

d) skreśla się pozycje w załączniku 1D do niniejszej dyrektywy;

e) pozycje przedstawione w załączniku 1E do niniejszej dyrektywy zmienia się za pomocą zastąpienia odniesień klasyfikacyjnych do "Muta. Cat. 3; R40" przez "Muta. Cat. 3; R68" oraz za pomocą zastąpienia odniesień w zakresie etykietowania R40 przez R68;

f) pozycje przedstawione w załączniku 1F do niniejszej dyrektywy zmienia się za pomocą zastąpienia odniesień klasyfikacyjnych do "Xn; R40" przez "Xn; R68" oraz za pomocą zastąpienia odniesień w zakresie etykietowania R40 przez R68;

g) pozycją przedstawioną w załączniku 1G do niniejszej dyrektywy zmienia się za pomocą zastąpienia odniesień granicznego stężenia do "Xn; R40/20/21/22" przez "Xn; R68/20/21/22";

h) pozycję przedstawioną w załączniku 1H do niniejszej dyrektywy zmienia się za pomocą zastąpienia odniesień granicznego stężenia do "Xn; R20/21/22-40/20/21/22" przez "Xn; R20/21/22-68/20/21/22";

i) pozycję przedstawioną w załączniku 1I do niniejszej dyrektywy zmienia się za pomocą zastąpienia odniesień klasyfikacyjnych do "Muta. Cat. 3; R40" przez "Muta. Cat. 3; R68";

j) pozycję przedstawioną w załączniku 1J do niniejszej dyrektywy zmienia się za pomocą zastąpienia odniesień klasyfikacyjnych do "Muta. Cat. 3; R40" przez "Muta. Cat. 3; R68" oraz przez dodanie R68 do etykiety.

2. Załącznik II musi zawierać szwedzką i fińską wersję i poprawki techniczne do niektórych wersji językowych. Załącznik II zastępuje się załącznikiem 2 do niniejszej dyrektywy.

3. Załącznik III musi zawierać szwedzką i fińską wersję i poprawki techniczne do niektórych wersji językowych. Załącznik III zastępuje się załącznikiem 3 do niniejszej dyrektywy.

4. Załącznik IV musi zawierać szwedzką i fińską wersję i poprawki techniczne do niektórych wersji językowych. Załącznik IV zastępuje się załącznikiem 4 do niniejszej dyrektywy.

5. W załączniku V wprowadza się następujące zmiany:

a) skreśla się rozdział B.1;

b) tytuł wersji angielskiej rozdziału B13/14 zastępuje się tekstem w załączniku 5A;

c) ostatnie zdanie wersji francuskiej ust. 1.4.2.2 rozdziału B.39 zastępuje się tekstem w załączniku 5B;

d) równanie w ostatnim zdaniu ppkt 1.7.1.6 wersji angielskiej rozdziału B.41 zastępuje się tekstem w załączniku 5C;

e) metodę badania dla badań podprzewlekłej toksyczności drogą pokarmową u gryzoni zmienia się zgodnie z załącznikiem 5D do niniejszej dyrektywy, który zastępuje rozdział B.26;

f) metodę badania dla badań podprzewlekłej toksyczności drogą pokarmową u niegryzoni zmienia się zgodnie z załącznikiem 5E do niniejszej dyrektywy, który zastępuje rozdział B.27;

g) siedem nowych metod badań dotyczących ekotoksyczności w załączniku 5F do niniejszej dyrektywy włącza się do części C.

6. Załącznik VI zawiera szwedzką i fińską wersję, poprawki techniczne do niektórych wersji językowych i dalsze szczegółowe uaktualnienia techniczne. Załącznik VI zastępuje się załącznikiem 6 do niniejszej dyrektywy.

7. Załącznik VII.A obejmuje dokumentację techniczną zawierającą opakowanie do badań dla półproduktu z ograniczoną ekspozycją, dostarczające informacji niezbędnych do oceny przewidywanego zagrożenia dla ludzi i środowiska naturalnego. W załączniku VII.A wprowadza się następujące zmiany:

a) tekst w załączniku 7A do niniejszej dyrektywy dodaje się przed pkt 0 załącznika VII.A;

b) tekst w załączniku 7B do niniejszej dyrektywy dodaje się na końcu załącznika VII.A.

8. Załącznik VIII zawiera dodatkowe badania i badania, które mogą być wymagane dla półproduktów z ograniczoną ekspozycją, wprowadzanych do obrotu w dużej ilości. W załączniku VIII wprowadza się zatem następujące zmiany:

a) tekst w załączniku 8A do niniejszej dyrektywy dodaje się do załącznika VIII między "Poziom 1" i "Badania fizykochemiczne";

b) tekst w załączniku 8B do niniejszej dyrektywy dodaje się do załącznika VIII między "Poziom 2" i "Badania toksykologiczne".

Artykuł 2

Państwa Członkowskie stosują przepisy ustawowe, wykonawcze i administracyjne określone w ust. 1:

a) od dnia 30 lipca 2002 r. lub wcześniej w odniesieniu do substancji niebezpiecznych;

b) od dnia 30 lipca 2002 r. w odniesieniu do preparatów nieobjętych zakresem dyrektywy Rady 91/414/EWG ⁽⁶⁾ lub dyrektywą Parlamentu Europejskiego i Rady 98/8/WE ⁽⁷⁾;

c) od dnia 30 lipca 2004 r. w odniesieniu do preparatów objętych zakresem dyrektywy 91/414/EWG lub dyrektywy 98/8/WE.

Niezwłocznie powiadamiają o tym Komisję.

Przepisy przyjęte przez Państwa Członkowskie zawierają odniesienie do niniejszej dyrektywy lub odniesienie takie towarzyszy ich urzędowej publikacji. Państwa Członkowskie określają metody dokonywania takiego odniesienia.

Artykuł 4

Niniejsza dyrektywa skierowana jest do Państw Członkowskich.

Sporządzono w Brukseli, dnia 6 sierpnia 2001 r.

	W imieniu Komisji
	Margot WALLSTRÖM
	Członek Komisji

⁽¹⁾Dz.U. 196 z 16.8.1967, str. 1.

⁽²⁾Dz.U. L 136 z 8.6.2000, str. 90.

⁽³⁾Dz.U. L 199 z 30.7.1999, str. 57.

⁽⁴⁾Dz.U. L 358 z 18.12.1986, str. 1.

⁽⁵⁾Dz.U. L 200 z 30.7.1999, str. 1.

⁽⁶⁾Dz.U. L 230 z 19.8.1991, str. 1.

⁽⁷⁾Dz.U. L 123 z 24.4.1998, str. 1.

ZAŁĄCZNIKI

..................................................

Notka Wydawnictwa Prawniczego "Lex"

Grafiki zostały zamieszczone wyłącznie w Internecie. Obejrzenie grafik podczas pracy z programem Lex wymaga dostępu do Internetu.

..................................................

ZAŁĄCZNIK 1A

WSTĘP DO ZAŁĄCZNIKA I

Wprowadzenie

Załącznik I jest indeksem substancji niebezpiecznych, w odniesieniu do których uzgodniono zharmonizowanie klasyfikacji i etykietowania na poziomie wspólnotowym, zgodnie z procedurą przewidzianą w art. 4 ust. 3 niniejszej dyrektywy.

Numerowanie pozycji

Pozycje w załączniku I są wymienione według liczby atomowej pierwiastka najbardziej charakterystycznego dla właściwości substancji. Wykaz pierwiastków chemicznych, ułożony według liczb atomowych, przedstawiono w tabeli A. Substancje organiczne, z uwagi na ich różnorodność, umieszczono w zwykłych klasach, jak przedstawiono w tabeli B.

Numer indeksu każdej substancji jest w postaci sekwencji cyfrowej typu ABC-RST-VW-Y, gdzie:

– ABC jest albo liczbą atomową najbardziej charakterystycznego pierwiastka chemicznego (poprzedzonego jednym lub dwoma zerami do zapełnienia sekwencji) albo zwykłym numerem klasy dla substancji organicznych,

– RST jest kolejnym numerem substancji w seriach ABC,

– Vw oznacza postać, w której substancja jest produkowana lub wprowadzana do obrotu,

– Y jest liczbą kontrolną obliczoną zgodnie z metodą ISBN (International Standard Book Number).

Dla przykładu, numer indeksu dla chlorku sodowego: 017-005-00-9.

W odniesieniu do substancji niebezpiecznych w Europejskim Spisie Istniejących Substancji Chemicznych o Znaczeniu Handlowym (EINECS) (Dz.U. C 146A z 15.06.1990) włączono numer EINECS. Taki numer jest tworzony w systemie siedmiocyfrowym typu XXX-XXX-X rozpoczynającym się od 200-001-8.

W odniesieniu do substancji niebezpiecznych zgłoszonych zgodnie z przepisami niniejszej dyrektywy włączono numery substancji w Europejskim Wykazie Zgłoszonych substancji (ELINCS). Taki numer jest tworzony w systemie siedmiocyfrowym typu XXX-XXX-X rozpoczynającym się od 400-010-9.

W odniesieniu do substancji niebezpiecznych w wykazie "niskocząsteczkowe polimery" (dokument, Urząd Oficjalnych Publikacji Wspólnot Europejskich, 1997 r., ISBN 92-827-8995-0) włączono numer "niskocząsteczkowych polimerów". Taki numer jest tworzony w systemie siedmiocyfrowym typu XXX-XXX-X rozpoczynającym się od 500-001-0.

Numer CAS (Chemical Abstracts Service) jest również włączony w celu pomocy w określeniu pozycji. Należy zwrócić uwagę, że numer EINECS zawiera obie, bezwodną i uwodnioną postać substancji, natomiast występują często różne numery CAS dla postaci bezwodnych i uwodnionych. Numer CAS włączony jest tylko dla postaci bezwodnych, a zatem przedstawiony numer CAS nie zawsze opisuje pozycję tak dokładnie jak numer EINECS.

Numery EINECS, ELINCS, "niskocząsteczkowe polimery" lub CAS nie są zwykle włączone do pozycji, które obejmują więcej niż cztery poszczególne substancje.

Nomenklatura

We wszystkich możliwych przypadkach substancje niebezpieczne są wyznaczane przez ich nazwy umieszczone w EINECS, ELINCS lub "polimerach niskocząsteczkowych". Inne substancje niewymienione w EINECS, ELINCS lub w wykazie "polimery niskocząsteczkowe" są wyznaczane przy wykorzystaniu uznanych międzynarodowo nazw chemicznych (np. ISO, IUPAC). W niektórych przypadkach włączono nazwy zwyczajowe.

Zanieczyszczenia, dodatki i niewielkie składniki, zwykle nie są wymieniane, chyba że znacząco przyczyniają się do sklasyfikowania substancji.

Niektóre substancje są opisane jako mieszanina A i B. Te pozycje odnoszą się do jednej szczególnej mieszaniny. W pewnych przypadkach, gdy niezbędne jest scharakteryzowanie substancji wprowadzanej do obrotu, określane są proporcje głównych substancji w mieszaninie.

Niektóre substancje są opisane z podaniem właściwej czystości procentowej. Substancje mające wysoką zawartość materiału aktywnego (np. organiczny nadtlenek) nie są włączone do pozycji załącznika i mogą mieć inne niebezpieczne właściwości (np. wybuchowe). W przypadku gdy przedstawiono granice stężenia właściwego, stosuje się to do substancji przedstawionych na pozycji listy. W szczególności, w przypadku pozycji, które są mieszaniną substancji opisanych z podaniem właściwej czystości procentowej, granice stosuje się do substancji opisanej w załączniku I, a nie substancji czystej.

Art. 23 ust. 2 lit. a) wymaga, aby w odniesieniu do substancji wskazanej w załączniku I nazwa substancji, która ma być wykorzystana na etykiecie, odpowiadała jednemu z oznaczeń podanych w załączniku. W odniesieniu do niektórych substancji podano dodatkowe informacje w nawiasach kwadratowych w celu ułatwienia identyfikacji substancji. Te informacje dodatkowe nie muszą być zamieszczone na etykiecie.

Niektóre pozycje zawierają odniesienie do zanieczyszczeń. Przykładem jest indeks No 607-190-00-X: akryloamidometoksyoctan metylu (zawierający ≥ 0,1% akryloamidu). W tych przypadkach odniesienia w nawiasach tworzą część nazwy i muszą być zamieszczone na etykiecie.

Niektóre pozycje odnoszą się do grup substancji. Przykładem jest indeks No 006-007-00-5: "cyjanowodór (sole...), z wyjątkiem kompleksowych cyjanków, takich jak: żelazocyjanki, żelazicyjanki i cyjanki rtęciowe". W odniesieniu do poszczególnych substancji objętych tymi pozycjami nazwę EINECS lub inna nazwa uznana międzynarodowo musi być wykorzystana.

Format pozycji

Podano następujące informacje w odniesieniu do każdej substancji w załączniku I:

a) klasyfikacja:

i) proces klasyfikacji obejmuje umieszczenie substancji w jednej lub więcej kategorii niebezpieczeństwa (jak określono w art. 2 ust. 2 dyrektywy Rady 92/32/EWG (Dz.U. L 154 z 5.6.1992, str. 1)) oraz przypisanie kwalifikacji oznaczenia ryzyka "R". Klasyfikacja ma wpływ nie tylko na etykietowanie, ale również na inne środki prawodawcze i regulacyjne dotyczące substancji niebezpiecznych;

ii) klasyfikacja w odniesieniu do każdej kategorii niebezpieczeństwa jest zwykle przedstawiana w postaci skróconej przedstawiającej kategorię niebezpieczeństwa wraz z właściwym oznaczeniem ryzyka "R". Jednakże w niektórych przypadkach (np. substancji sklasyfikowanych jako łatwopalne, uczulające oraz niektórych substancji sklasyfikowanych jako niebezpieczne dla środowiska naturalnego), wykorzystuje się samo oznaczenie ryzyka "R";

iii) skróty w odniesieniu do każdej z kategorii niebezpieczeństwa przedstawiono poniżej:

– wybuchowe: E

– utleniające: O

– skrajnie łatwopalne: F+

– wysoce łatwopalne: F

– łatwopalne: R10

– bardzo toksyczne: T+

– toksyczne: T

– szkodliwe: Xn

– żrące: C

– drażniące: Xi

– uczulające: R42 i/lub R43

– rakotwórcze: Carc. Cat.⁽¹⁾

– mutagenne: Muta. Cat.⁽¹⁾

– toksyczne dla rozrodczości: Repr. Cat.⁽¹⁾

– niebezpieczne dla środowiska naturalnego: N lub/i R52, R53, R59;

iv) dodatkowe oznaczenia ryzyka "R", które przyporządkowano innym właściwościom (patrz ppkt. 2.2.6 i 3.2.8 wskazówek dotyczących etykietowania) są przedstawione, mimo że nie stanowią formalnie części klasyfikacji;

b) etykieta, obejmująca:

i) literę przyporządkowaną substancji zgodnie z załącznikiem II (patrz art. 23 ust. 2 lit. c)). Tworzą one skróty dla symboli i wskazania zagrożenia (jeśli są one przyporządkowane);

ii) oznaczenie ryzyka "R", oznaczone jako seria liczb poprzedzonych literą R wskazujących charakter szczególnego ryzyka, zgodnie z załącznikiem III (patrz art. 23 ust. 2 lit. d)). Liczby są oddzielone za pomocą:

– myślnika (-) w celu wskazania odrębnych oświadczeń dotyczących szczególnego ryzyka (R), albo

– ukośnik (/) w celu wskazania połączonego oświadczenia, w jednym zdaniu, dotyczącego szczególnego ryzyka, jak określono w załączniku III;

iii) sformułowania dotyczące bezpieczeństwa, oznaczone jako seria liczb poprzedzona literą S wskazującą zalecane środki bezpieczeństwa zgodnie z załącznikiem IV (patrz art. 23 ust. 2 lit. e)). Ponownie liczby są oddzielone myślnikiem albo ukośnikiem; znaczenie zalecanych środków bezpieczeństwa jest określone w załączniku IV. Przedstawione sformułowania dotyczące bezpieczeństwa stosuje się tylko do substancji; w odniesieniu do preparatów sformułowania są wybierane zgodnie ze zwykłymi regułami.

Należy zwrócić uwagę, że w odniesieniu do niektórych substancji i preparatów niebezpiecznych sprzedawanych ogółowi społeczeństwa sformułowania S są obowiązkowe.

S1, S2 i S45 są obowiązkowe w odniesieniu do wszystkich bardzo toksycznych, toksycznych i żrących substancji i preparatów sprzedawanych ogółowi społeczeństwa.

S2 i S46 są obowiązkowe w odniesieniu do wszystkich innych substancji i preparatów niebezpiecznych sprzedawanych ogółowi społeczeństwa, innych niż te, które zostały tylko sklasyfikowane jako niebezpieczne dla środowiska naturalnego.

Sformułowania dotyczące bezpieczeństwa S1 i S2 są przedstawione w nawiasach w załączniku i mogą być pominięte na etykiecie, gdy substancje lub preparaty są sprzedawane tylko do stosowania przemysłowego;

c) granice stężeń i towarzyszące klasyfikacje niezbędne do sklasyfikowania preparatów niebezpiecznych zawierających substancje zgodnie z dyrektywą 1999/45/WE.

Jeśli nie wskazano inaczej, granice stężeń są wyrażone jako procent wagowy substancji, obliczony w stosunku do całkowitej wagi preparatu.

W przypadku, gdy nie podano granic stężenia, granice stężeń, które mają być wykorzystane przy stosowaniu metody konwencjonalnej oceny niebezpieczeństwa dla zdrowia, są granicami w załączniku II, natomiast przy stosowaniu oceny metodą konwencjonalną niebezpieczeństwa dla środowiska naturalnego - są granicami w załączniku III dyrektywy Rady i Parlamentu Europejskiego 1999/45/WE (Dz.U. L 200 z 30.7.1999, str. 1).

Ogólne uwagi objaśniające

Grupy substancji

Numery pozycji grup są włączone do załącznika I. W tych przypadkach wymagania klasyfikacji i etykietowania będą miały zastosowanie do wszystkich substancji objętych opisem, jeśli są one wprowadzone do obrotu, w zakresie w jakim są wymienione w EINECS lub ELINCS. W przypadku gdy substancja objęta pozycją grupy występuje jako zanieczyszczenie w innej substancji, wymagania klasyfikacji i etykietowania opisane w pozycji grupy są uwzględniane przy etykietowaniu substancji.

W niektórych przypadkach istnieją wymagania klasyfikacji i etykietowania dotyczące szczególnych substancji, które byłyby objęte pozycją grupy. W takich przypadkach istnieje szczególna pozycja załącznika I odnosząca się do pozycji substancji i pozycji grupy z adnotacją w postaci sformułowania "z wyjątkiem tych określonych gdzie indziej w niniejszym załączniku".

W niektórych przypadkach poszczególne substancje mogą być objęte więcej niż jedną pozycją grupy. Szczawian ołowiu (nr EINECS 212-413-5) jest na przykład objęty pozycją odnoszącą się do związków ołowiu (indeks nr 082-001-00-6), jak również odnoszącą się do soli kwasu szczawiowego (607-007-00-3). W tych przypadkach etykietowanie substancji odzwierciedla etykietowanie w odniesieniu do każdej z dwóch pozycji grupy. W przypadkach gdy są podane różne klasyfikacje w odniesieniu do tego samego niebezpieczeństwa, klasyfikacja prowadząca do bardziej rygorystycznego klasyfikowania jest wykorzystywana w odniesieniu do etykiet poszczególnych substancji (patrz podpunkt poniżej, uwaga A).

Pozycje w załączniku I odnoszące się do soli (pod jakąkolwiek nazwą) obejmują postacie zarówno bezwodne, jak i uwodnione, chyba że w szczególny sposób zostało to określone inaczej.

Substancje z numerem ELINCS

W załączniku I substancje z numerem ELINCS, zostały z zgłoszone na mocy przepisów niniejszej dyrektywy. Producent lub importer, który wcześniej nie zgłosił tych substancji, musi odwołać się do przepisów niniejszej dyrektywy, jeśli zamierza wprowadzić te substancje do obrotu.

Objaśnienie uwag odnoszących się do identyfikacji, klasyfikacji i etykietowania substancji

Uwaga A:

Nazwa substancji musi występować na etykiecie w postaci jednego z oznaczeń podanych w załączniku I (patrz art. 23 ust. 2 lit. a)).

W załączniku I używa się czasem ogólnego opisu, jak "... związki" lub "... sole". W tym przypadku producent lub każda inna osoba, która wprowadza taką substancję do obrotu, jest zobowiązana do podania na etykiecie prawidłowej nazwy, przy należytym uwzględnieniu rozdziału wstępu zatytułowanego "Nomenklatura":

Przykład: dla BeCl₂ (nr EINECS 232-116-4): chlorek berylowy.

Dyrektywa wymaga także, aby symbole, oznaczenia niebezpieczeństwa, sformułowania R i S, które mają być wykorzystane w odniesieniu do każdej substancji, były sformułowaniami wskazanymi w załączniku I (art. 23 ust. 2 lit. c), d) i e)).

W odniesieniu do substancji należących do jednej określonej grupy substancji zawartej w załączniku I symbole, oznaczenia niebezpieczeństwa, sformułowania R i S, które mają być wykorzystane w odniesieniu do każdej substancji, są tymi przedstawionymi we właściwej pozycji w załączniku I.

W odniesieniu do substancji należących do więcej niż jednej grupy substancji zawartych w załączniku I, symbole, oznaczenia niebezpieczeństwa, sformułowania R i S, które mają być wykorzystane w odniesieniu do każdej substancji, są tymi przedstawionymi w obu właściwych pozycjach podanych w załączniku I. W przypadkach gdy dwie różne klasyfikacje są podane w dwóch pozycjach w odniesieniu do tego samego niebezpieczeństwa, wykorzystuje się klasyfikację odzwierciedlającą niebezpieczeństwo wyższego stopnia.

Przykład:

dla substancji AB - brak oddzielnej pozycji w załączniku I:

pozycja grupy załącznika I odnosząca się do związków A:

Repr. Cat. 1; R61 Repr. Cat. 3; R62 Xn; R20/22 R33 N; R50-53

pozycja grupy załącznika I odnosząca się do związków B:

Carc. Cat. 1; R45 T; R23/25 N; R51-53

Zatem klasyfikacja substancji staje się:

Carc. Cat. 1; R45 Repr. Cat. 1; R61 Repr. Cat. 3; R62 T; R23/25 R33 N; R50-53.

Uwaga B:

Niektóre substancje (kwasy, zasady itp.) są wprowadzane do obrotu w postaci wodnych roztworów o różnych stężeniach i dlatego roztwory te wymagają różnego etykietowania, ponieważ niebezpieczeństwo zmienia się przy różnych stężeniach.

W załączniku I pozycje z uwagą B mają ogólne oznaczenie następującego rodzaju: "kwas azotowy ...%".

W tym przypadku producent lub każda inna osoba, która wprowadza do obrotu takie substancje w roztworze wodnym, musi podać na etykiecie stężenie procentowe roztworu.

O ile nie określono inaczej, przyjmuje się, że stężenie procentowe jest obliczone wagowo.

Wykorzystanie dodatkowych danych (np. ciężar właściwy, stopnie Baumé) lub sformułowań opisowych (np. dymiący lub lodowaty) jest dopuszczalne.

Uwaga C:

Niektóre substancje organiczne są wprowadzane do obrotu w postaci izomeru właściwego albo w postaci mieszaniny kilku izomerów.

W załączniku I jako ogólnego oznaczenia następnego rodzaju wykorzystuje się czasami: "ksylenol".

W tym przypadku producent lub każda inna osoba, która wprowadza do obrotu taką substancję, musi podać na etykiecie, czy substancja jest izomerem właściwym (a), czy mieszaniną izomerów (b).

Przykład:	a) 2,4-dimetylofenol
	b) ksylenol (mieszanina izomerów).

Uwaga D:

Niektóre substancje, które są skłonne do samorzutnej polimeryzacji lub rozkładu, są generalnie wprowadzane do obrotu w stabilizowanej postaci. Jest to postać, w jakiej są one wymienione w załączniku I do niniejszej dyrektywy.

Jednakże takie substancje są czasem wprowadzane do obrotu w postaci niestabilizowanej. W tym przypadku producent lub każda inna osoba, która wprowadza do obrotu taką substancję, musi podać na etykiecie nazwę substancji, a następnie wyraz "niestabilizowany".

Uwaga E:

Substancje o szczególnym działaniu na zdrowie człowieka (patrz rozdział 4 załącznika VI) są sklasyfikowane jako rakotwórcze, mutagenne i/lub toksyczne dla rozrodczości w kategoriach 1 lub 2, są przypisane uwadze E, jeśli są one również sklasyfikowane jako bardzo toksyczne (T+), toksyczne (T) lub szkodliwe (Xn). W odniesieniu do tych substancji oznaczenie ryzyka "R": R20, R21, R22, R23, R24, R25, R26, R27, R28, R39, R68 (szkodliwa), R48 i R65, i wszystkie połączenia tych oznaczeń ryzyka "R" są poprzedzone wyrazem "również".

Przykłady:	R45-23
	R46-27/28.	"Może powodować dziedziczne uszkodzenia genetyczne. Również bardzo toksyczny w kontakcie ze skórą i w przypadku spożycia".

Uwaga F:

Substancja ta może zawierać stabilizator. Jeśli stabilizator zmienia niebezpieczne właściwości substancji, jak wskazano na etykiecie w załączniku I, etykieta powinna być określona zgodnie z regułami etykietowania preparatów niebezpiecznych.

Uwaga G:

Substancja ta może być wprowadzona do obrotu w postaci wybuchowej i w tym przypadku musi być oceniona właściwymi metodami badania, a etykieta powinna być określona, aby odzwierciedlać jej właściwości wybuchowe.

Uwaga H:

Klasyfikacja i etykieta przedstawione w odniesieniu do tej substancji mają zastosowanie do niebezpiecznych właściwości oznaczonych za pomocą oznaczenia(-ń) ryzyka "R" w połączeniu ze wskazaną kategorią(-ami) niebezpieczeństwa. Wymagania art. 6 niniejszej dyrektywy dotyczące producentów, dystrybutorów oraz importerów tej substancji mają zastosowanie do wszystkich innych aspektów klasyfikacji i etykietowania. Ostateczna etykieta odpowiada wymaganiom pkt 7 załącznika VI niniejszej dyrektywy.

Niniejszą uwagę stosuje się do niektórych węglopochodnych i olejopochodnych substancji oraz do niektórych pozycji odnoszących się do grup substancji w załączniku I.

Uwaga J:

Sklasyfikowanie jako rakotwórczy nie powinno mieć zastosowania, jeśli można wykazać, że substancja zawiera mniej niż 0,1% wagowo benzenu (nr EINECS 200-753-7). Niniejszą uwagę stosuje się tylko do niektórych substancji kompleksowych pochodnych węgla i olejów w załączniku I.

Uwaga K:

Sklasyfikowanie jako rakotwórczy nie powinno mieć zastosowania, jeśli można wykazać, że substancja zawiera mniej niż 0,1% wagowo 1,3-butadienu (nr EINECS 203-450-8). Jeśli substancja nie jest sklasyfikowana jako rakotwórcza, należy zastosować przynajmniej sformułowania S (2-)9-16. Niniejszą uwagę stosuje się tylko do niektórych substancji kompleksowych pochodnych węgla i olejów w załączniku I.

Uwaga L:

Sklasyfikowanie jako rakotwórczy nie powinno mieć zastosowania, jeśli można wykazać, że substancja zawiera mniej niż 3% DMSO ekstraktu, zmierzonego metodą IP 346. Niniejszą uwagę stosuje się tylko do niektórych substancji kompleksowych pochodnych olejów w załączniku I.

Uwaga M:

Sklasyfikowanie jako rakotwórczy nie powinno mieć zastosowania, jeśli można wykazać, że substancja zawiera mniej niż 0,005% wagowo benzo[a]-pirenu (nr EINECS 200-028-5). Niniejszą uwagę stosuje się tylko do niektórych substancji kompleksowych pochodnych węgla w załączniku I.

Uwaga N:

Sklasyfikowanie jako rakotwórczy nie powinno mieć zastosowania, jeśli znana jest pełna historia rafinacji i można wykazać, że substancja, z której jest produkowana, nie jest rakotwórcza. Niniejszą uwagę stosuje się tylko do niektórych substancji kompleksowych pochodnych olejów w załączniku I.

Uwaga P:

Sklasyfikowanie jako rakotwórczy nie powinno mieć zastosowania, jeśli można wykazać, że substancja zawiera mniej niż 0,1% wagowo benzenu (nr EINECS 200-753-7).

Jeśli substancja jest sklasyfikowana jako rakotwórcza, uwaga E ma również zastosowanie.

Jeśli substancja nie jest sklasyfikowana jako rakotwórcza, stosuje się przynajmniej sformułowania S (2-)23-24-62.

Niniejszą uwagę stosuje się tylko do niektórych substancji kompleksowych pochodnych olejów w załączniku I.

Uwaga Q:

Sklasyfikowanie jako rakotwórczy nie powinno mieć zastosowania, jeśli można wykazać, że substancja spełnia jeden z następujących warunków:

– krótkoterminowe badanie biopersistencji przez wdychanie wykazało, że włókna dłuższe niż 20 µm mają ważony czas połowicznego zaniku mniej niż 10 dni, lub

– krótkoterminowe badanie biopersistencji przez śródtchawiczne wkroplenie wykazało, że włókna dłuższe niż 20 µm mają ważony czas połowicznego zaniku mniej niż 40 dni, lub

– właściwe badanie śródotrzewnowe nie wykazało żadnych dowodów na wzrost rakotwórczości, lub

– nieobecność stosownych zmian patogenicznych i rakotwórczych w odpowiednim długoterminowym badaniu wdychania.

Uwaga R:

Sklasyfikowanie jako rakotwórczy nie powinno mieć zastosowania do włókien o średniej długości ważonej geometrycznie średnicą mniejszą od dwóch standardowych błędów, większą niż 6 µm.

Uwaga S:

Niniejsza substancja nie wymaga etykiety zgodnie z art. 23 (patrz pkt 8 załącznika VI).

Wyjaśnienie uwag odnoszących się do etykietowania preparatów

Znaczenie uwag występujących z prawej strony granic stężenia jest następujące:

Uwaga 1:

Podane stężenie lub - w przypadku nieobecności takiego stężenia - ogólnie stężenia dyrektywy 1999/45/WE stanowią procenty wagowe pierwiastka metalicznego, obliczone w stosunku do całkowitej wagi preparatu.

Uwaga 2:

Podane stężenie izocyjanku jest procentem wagi wolnego monomeru, obliczonym w stosunku do całkowitej wagi preparatu.

Uwaga 3:

Podane stężenie jest procentem wagi jonów chromianowych rozpuszczonych w wodzie, obliczonym w stosunku do całkowitej wagi preparatu.

Uwaga 4:

Preparaty zawierające te substancje muszą być sklasyfikowane jako szkodliwe ze sformułowaniem R65, jeśli spełniają kryteria w ppkt 3.2.3 załącznika VI.

Uwaga 5:

Granice stężenia w odniesieniu do preparatów gazowych są wyrażone jako procentowe stężenie objętościowe.

Uwaga 6:

Preparaty zawierające te substancje muszą być określone sformułowaniem R67, jeśli spełniają kryteria w ppkt 3.2.8 załącznika VI.

Niniejsza uwaga nie może być stosowana dłużej niż do daty wejścia w życie kryteriów wykorzystania sformułowania R67 przewidzianego w dyrektywie 1999/45/WE.

⁽¹⁾ Kategorie rakotwórczy, mutagenny lub toksyczny dla rozrodczości (np. 1, 2 lub 3) przedstawiono stosownie do potrzeb.

grafika

ZAŁĄCZNIK 5D

B.26. BADANIE TOKSYCZNOŚCI PODPRZEWLEKŁEJ DROGĄ POKARMOWĄ STUDIUM TOKSYCZNOŚCI NA GRYZONIACH METODĄ POWTARZANEJ 90-DNIOWEJ DAWKI DROGĄ POKARMOWĄ

1. METODA

Niniejsza metoda badania toksyczności podprzewlekłej drogą pokarmową jest kopią OECD TG 408 (1998).

1.1. WPROWADZENIE

Przy oszacowaniu i ocenie cech toksyczności substancji chemicznej oznaczenie podprzewlekłej toksyczności drogą pokarmową, stosując powtarzane dawki, jest prowadzone po początkowej informacji o toksyczności, uzyskanej z 28-dniowych badań toksyczności ostrej lub powtarzanej. 90-dniowe badanie dostarcza informacji o możliwym niebezpieczeństwie dla zdrowia, które prawdopodobnie powstanie z powtarzanego narażenia w ciągu przedłużonego okresu czasu, obejmującego moment odstawienia od piersi, poprzez rozwój do dojrzałości. Badanie dostarczy informacji na temat głównych toksycznych działań, wskaże zaatakowane organy i możliwości akumulacji, dostarczy oceny poziomu ekspozycji na badania niepowodującego negatywnych skutków, którą stosuje się przy wyborze poziomów dawki dla badań przewlekłych i ustalania kryteriów bezpieczeństwa dla narażenia ludzi.

Metoda kładzie dodatkowy nacisk na aspekt neurologiczny i wskazuje oddziaływania na układ immunologiczny i rozrodczy. Potrzeba starannej klinicznej obserwacji zwierząt, aby uzyskać tak wiele informacji, jak to możliwe, jest również stresująca. Niniejsze badanie powinno umożliwić określenie substancji chemicznych, które mogą potencjalnie powodować działania neurotoksyczne, immunologiczne lub wpływać na organy rozrodcze oraz uzasadniające dalsze dogłębne ich zbadanie.

Patrz także wprowadzenie ogólne, część B.

1.2. DEFINICJE

Dawka: jest ilością podawanej substancji badanej. Dawka jest wyrażana wagowo (g, mg), lub jako waga substancji badanej na jednostkę wagi badanego zwierzęcia (np. mg/kg), lub jako stężenie stałe żywieniowe (ppm).

Dawkowanie: jest ogólnym pojęciem obejmującym dawkę, jej częstotliwość i czas podawania dawki.

NOAEL: jest skrótem od poziomu, przy którym nie obserwuje się niekorzystnych skutków oraz jest najwyższym poziomem dawki, gdzie nie obserwuje się niekorzystnych efektów zależnych od podawanej substancji.

1.3. ZASADA METODY BADANIA

Badana substancja jest codziennie podawana doustnie w stopniowanych dawkach, kilku grupom zwierząt doświadczalnych, jeden poziom dawki na grupę przez okres 90 dni. W czasie okresu podawania zwierzęta są ściśle obserwowane w zakresie oznak zatrucia. Zwierzęta, które zmarły lub zostały zabite w czasie trwania badania, są poddawane sekcji zwłok, po zakończeniu badania zwierzęta, które przeżyły, są również zabijane i poddawane sekcji zwłok.

1.4. OPIS METODY BADANIA

1.4.1. Przygotowanie zwierząt

Muszą zostać użyte zdrowe zwierzęta, zaaklimatyzowane w warunkach laboratoryjnych przez przynajmniej pięć dni i niebędące przedmiotem wcześniejszych procedur eksperymentalnych. Zwierzęta badane muszą charakteryzować się gatunkiem, szczepem, źródłem, płcią, wagą i/lub wiekiem. Zwierzęta muszą być losowo wyznaczane do doświadczeń kontrolnych i grup traktowanych. Klatki muszą być rozmieszczone w sposób, aby możliwy wpływ wynikający z ich przemieszczenia był minimalny. Każde zwierzę musi być oznakowane niepowtarzalnym numerem identyfikacyjnym.

1.4.2. Przygotowanie dawek

Substancja badana jest podawana przez zgłębnik lub w postaci pokarmu, lub wody pitnej. Metoda podawania drogą pokarmową jest zależna od celu badania oraz właściwości fizykochemicznych badanego materiału.

Tam gdzie jest to konieczne, badaną substancję rozpuszcza się lub wykonuje zawiesinę w odpowiednim nośniku. Zalecane jest, aby tam, gdzie to jest możliwe, rozważyć wpierw użycie roztworu lub zawiesiny wodnej, a następnie rozważyć wykonanie roztworu/zawiesiny w oleju (np. w oleju kukurydzianym) i dopiero następnie w innych nośnikach. Dla nośników różnych od wody muszą być znane cechy toksyczności. Powinna być określona stabilność badanej substancji w warunkach podawania dawek.

1.4.3. Warunki badania

1.4.3.1. Zwierzęta eksperymentalne

Zalecanym gatunkiem jest szczur, ale także inne gatunki gryzoni, np. mysz. Powinny być wykorzystane zwykłe stosowane laboratoryjne szczepy zdrowych dorosłych zwierząt. Samice muszą być zeroroczne, nieciężarne. Dozowanie musi rozpocząć się tak szybko, jak to możliwe, po odłączeniu od matki, a w każdym przypadku przed osiągnięciem wieku dziewięciu tygodni. Przy rozpoczęciu badań zmiany wagi wykorzystanych zwierząt muszą być minimalne i nie przekraczać ± 20% średniej wagi w każdej płci. W przyadku gdy badania są prowadzone jako wstępne do badań toksyczności przewlekłej długoterminowej, do obu badań należy wykorzystać zwierzęta tego samego szczepu i źródła.

1.4.3.2. Ilość i płeć

Co najmniej 20 zwierząt (10 samic i 10 samców) należy wykorzystać w odniesieniu do każdego poziomu dawki. Jeśli planuje się zabijanie pośrednie, liczba musi być zwiększona o przewidzianą ilość zwierząt do zabicia przed zakończeniem badań. Na podstawie wcześniejszej wiedzy o substancjach chemicznych i bliskich odpowiednikach należy rozważyć włączenie dodatkowej satelickiej grupy 10 zwierząt (po 5 każdej płci) do grupy kontrolnej i grupy najwyżej dawkowanej, do celów obserwacji, po okresie traktowania, odwracalności lub trwałości jakichkolwiek skutków toksycznych. Czas trwania tego okresu po zakończeniu traktowania powinien być ustalony odpowiednio w odniesieniu do obserwowanych skutków.

1.4.3.3. Poziomy dawek

Stosuje się co najmniej trzy poziomy dawek i równoczesne doświadczenie kontrolne, poza przypadkiem gdy prowadzone jest badanie graniczne (patrz 1.4.3.4). Poziomy dawek mogą być oparte na wynikach powtarzanej dawki lub badaniach ustalania zakres oraz powinny uwzględniać wszelkie istniejące dane toksykologiczne i toksykokinetyczne, dostępne w odniesieniu do badanej substancji lub związanych z nią materiałów. Poza ograniczeniami natury fizykochemicznej i działaniami biologicznymi substancji badanej poziom najwyższej dawki musi być wybrany w celu wzbudzenia objawów toksycznych, ale nie spowodowania śmierci czy też poważnych cierpień. Opadająca sekwencja poziomu dawki musi być wybrana w celu pokazania reakcji związanej z dawkowaniem i poziomem, przy którym nie obserwuje się negatywnych skutków (NOAEL) przy najniższym poziomie dawki. Dwa do czterech zachodzące przedziały są często optymalne do ustalenia opadających poziomów dawki i dodanie czwartej grupy badanej jest często polecane dla zastosowania bardzo dużych odstępów (np. więcej niż współczynnik 6-10) między dawkowaniami.

Grupa kontrolna musi być grupą nietraktowaną lub grupą kontrolną nośnika, jeśli nośnik jest używany do podawania substancji badanej. Zwierzęta w grupie kontrolnej, poza nietraktowaniem jej substancją badaną, są obsługiwane w identyczny sposób, jak w zwierzęta w grupach badanych. Jeśli stosowany jest nośnik, grupa kontrolna musi otrzymywać nośnik w maksymalnie stosowanej objętości. Gdy substancja badana jest podawana w diecie i powoduje zmniejszenie zapotrzebowania żywieniowego, wtedy grupa kontrolna z pary żywieniowej może być pomocna w rozróżnieniu między zmniejszeniem spowodowanym smacznością lub zmianami toksykologicznymi w modelu badania.

Następujące cechy nośnika i innych dodatków muszą być rozważone jako właściwe: wpływ wchłaniania, rozkładu, metabolizmu, retencji badanej substancji, wpływ właściwości chemicznych substancji badanej, mogące zmienić jej cechy toksyczności oraz wpływy zapotrzebowania na żywność i wodę lub żywieniowy status zwierząt.

1.4.3.4. Badanie graniczne

Jeśli badanie przy jednym poziomie dawki, równoważnym co najmniej 1.000 mg/kg masy ciała/dzień, stosując procedurę opisaną w odniesieniu do niniejszego badania, powoduje, że nie obserwuje się negatywnych skutków, oraz jeśli nie oczekuje się toksyczności na podstawie danych substancji strukturalnie związanych, wtedy pełne badania z zastosowaniem trzech poziomów nie wydają się konieczne. Badanie graniczne ma zastosowanie, z wyjątkiem sytuacji, gdy narażenie ludzi wskazuje potrzebę zastosowania wyższego poziomu dawki.

1.5. PROCEDURA

1.5.1. Podawanie dawek

Zwierzętom dozuje się substancję badaną przez siedem dni każdego tygodnia w okresie 90 dni. Każdy inny sposób dozowania, na przykład pięć dni w tygodniu wymaga uzasadnienia. Gdy substancja badana jest podawana przez zgłębnik, musi być to wykonane w pojedynczej dawce, przy użyciu sondy przełykowej lub odpowiedniej kaniuli intubacyjnej. Maksymalna objętość cieczy, która może być podana w jednym momencie, zależy od rozmiarów zwierzęcia badanego. Objętość nie może przekraczać 1 ml/100 g masy ciała, poza przypadkiem wodnych roztworów, gdzie można zastosować 2 ml/100 g masy ciała. Z wyjątkiem substancji drażniących i żrących, które zwykle ujawniają silniejsze działanie przy wyższym stężeniu, zmienności w objętości badanej muszą być zminimalizowane przez ustawienie stężenia tak, aby zapewnić stałą objętość we wszystkich poziomach dozowania.

W odniesieniu do substancji podawanych w pokarmie lub wodzie pitnej istotne jest zapewnienie, aby ilości danej substancji badanej nie kolidowały z normalnym odżywianiem lub równowagą wodną. Gdy substancja badana jest podawana w pokarmie - w stałym stężeniu w pokarmie (ppm) albo w stałym poziomie dawki - może być zastosowana w odniesieniu do masy ciała zwierzęcia, wykorzystana alternatywa musi być określona. W odniesieniu do substancji podawanej przez zgłębnik dawka musi być podana w podobnej porze każdego dnia i regulowana tak, by utrzymać stały poziom dawki w odniesieniu do masy ciała zwierzęcia. W przypadku gdy badanie 90-dniowe jest stosowane jako wstępne do badań długoterminowych toksyczności przewlekłej, w obu badaniach powinien być użyty podobny pokarm.

1.5.2. Obserwacje

Okres obserwacji powinien wynosić przynajmniej 90 dni. Zwierzęta w grupie satelickiej, zaplanowanej do dalszej obserwacji, muszą być trzymane przez stosowny okres bez traktowania w celu wykrycia wytrzymałości na lub powrotu do normy od działań toksycznych.

Ogólne kliniczne obserwacje powinny być dokonywane przynajmniej raz na dzień, najlepiej o tej(tych) samej(-ych) porze(porach) każdego dnia, uwzględniając szczytowy okres przewidywanego działania po dozowaniu. Stan kliniczny zwierząt powinien być rejestrowany. Co najmniej dwa razy dziennie, zwykle na początku i pod koniec każdego dnia, wszystkie zwierzęta są kontrolowane w zakresie oznak zachorowań i śmiertelności.

Przynajmniej raz, przed pierwszą ekspozycją (uwzględnić w granicach porównania), i raz tygodniowo później należy dokonać szczegółowej obserwacji klinicznej na wszystkich zwierzętach. Obserwacje te powinny być dokonywane poza klatką domową, najlepiej w warunkach standardowych za każdym razem w podobnych porach. Powinny one być starannie zapisane, najlepiej przez zastosowanie systemów punktacji, wyraźnie określonych przez laboratorium badawcze. Należy dołożyć starań w celu zapewnienia, aby zmiany w warunkach obserwacji były minimalne. Oznaki zauważone powinny obejmować zmiany na skórze, futrze, oczach, błonach śluzowych, występowanie wydzielin i czynności autonomiczne (np. łzawienie, piloerekcja, rozmiar źrenic, zmieniony rytm oddychania), lecz nie powinny być ograniczone tylko do nich. Zmiany w chodzie, postawie i reakcja na obchodzenie się, jak również obecność zachowań klonicznych i tonicznych, stereotypów (np. nadmiernie zajmują się sobą, kołowacizna) lub dziwaczne zachowanie (np. samookaleczanie, chodzenie wstecz) także muszą być zarejestrowane (1).

Badanie oftalmologiczne przy użyciu oftalmoskopu lub równoważnego odpowiedniego przyrządu musi być wykonane przed podawaniem dawek badanej substancji i przy ukończeniu badań, najlepiej na wszystkich zwierzętach, ale przynajmniej w grupach wysokiej dawki kontrolnej. Jeśli wykryto zmiany w oczach, należy przebadać wszystkie zwierzęta.

Odnośnie do końca okresu ekspozycji, a w żadnym przypadku nie wcześniej niż w 11 tygodniu, należy przeprowadzić badania reaktywności sensorycznej na bodźce różnych typów (1) (np. na bodźce słuchowe, optyczne i proprioreceptoryczne) (2), (3), (4), ocenę siły chwytu (5) i ocenę aktywności motorycznej (6). Dalsze szczegóły procedur do przeprowadzenia są podane w odpowiednich odniesieniach. Jednakże można także zastosować procedury alternatywne do tych, do których dokonano odniesień.

Obserwacje funkcjonalne prowadzone odnośnie do końca badań mogą być pominięte, jeśli dane dotyczące obserwacji funkcjonalnych są dostępne z innych badań i codzienne kliniczne obserwacje nie ujawniają żadnych deficytów funkcjonalnych.

Wyjątkowo, obserwacje funkcjonalne mogą być także pominięte w odniesieniu do grup, które w inny sposób przejawiają oznaki zatrucia do tego stopnia, że mogłyby znacznie zakłócić wykonanie badania funkcjonalnego.

1.5.2.1. Waga ciała i spożycie pokarmu/wody

Wszystkie zwierzęta powinny być ważone przynajmniej raz na tydzień. Pomiary spożycia pokarmu powinny być dokonywane przynajmniej co tydzień. Jeśli substancja badana jest podawana w wodzie pitnej, spożycie wody musi być także mierzone przynajmniej cotygodniowo. Spożycie wody może być także rozważone w odniesieniu do badań pokarmowych lub zgłębnika, w czasie których pragnienie może się zmienić.

1.5.2.2. Biochemia kliniczna i hematologia

Próbki krwi powinny być pobrane z nazwanego siedliska i przechowywane, jeśli ma to zastosowanie, we właściwych warunkach. Na końcu okresu badania próbki są zbierane tuż przed procedurą zabijania zwierząt lub jako jej część.

Następujące badania hematologiczne powinny być wykonane pod koniec okresu badania, a także gdy wszystkie pośrednie próbki krwi muszą zostać zebrane: hematokryt, stężenie hemoglobiny, liczba erytrocytów, całkowita i różnicowa liczba leukocytów, liczba płytek krwi i pomiar czasu/potencjał krzepnięcia krwi.

Oznaczenia biochemii klinicznej do badań głównych skutków toksycznych w tkankach, w szczególności działań na nerki i wątrobę, powinny być wykonane na próbkach krwi, uzyskanych od każdego zwierzęcia tuż przed lub jako część procedury zabijania zwierząt (oddzielnie od tych, które okazały się konające i/lub zabite w międzyczasie). W sposób podobny do badań hematologicznych może być wykonane pobieranie próbek w trakcie badań dla przeprowadzenia klinicznych badań biochemicznych. Zaleca się przetrzymanie zwierząt przez noc, przed pobraniem próbek krwi⁽¹⁾. Oznaczenia w plazmie lub surowicy muszą zawierać sód, potas, glukozę, całkowity cholesterol, mocznik, azot mocznikowy we krwi, kreatyninę, całkowite proteiny i albuminy i więcej niż dwa enzymy charakterystyczne efektów wątrobokomórkowych (takich jak alanina, aminotransferaza, asparaginian aminotransferazy, fosfataza alkaliczna, gamma glutamylotranspeptydaza i dehydrogenaza sorbitolowa). Można także włączyć pomiary dodatkowych enzymów (wątrobowego lub innego pochodzenia) i kwasów żółciowych, które pod pewnymi warunkami mogą dostarczyć użytecznych informacji.

Fakultatywnie można przeprowadzić następujące oznaczenia analityczne w moczu, w ciągu ostatniego tygodnia badań, stosując zebraną czasowo objętość moczu: przejrzystość, objętość, osmolality lub ciężar właściwy, pH, białka, glukoza i komórki krwi.

Dodatkowo należy rozważyć zastosowanie do badań surowicy znaczników ogólnego uszkodzenia tkanek. Inne oznaczenia, które powinny być dokonane, jeśli znane właściwości substancji badanej mogą lub są podejrzane o wpływ na przebieg metabolizmu, to wapń, fosfor, trwałe trójglicerydy, specyficzne hormony, metahemoglobina i cholinoesteraza. Mogą być one potrzebne do określenia niektórych związków chemicznych w niektórych klasach lub na zasadzie jednostkowych przypadków.

Ogólnie potrzebne jest elastyczne podejście, w zależności od gatunku oraz obserwowanych i/lub spodziewanych skutków pochodzących od danej substancji.

Jeśli historyczne dane bazowe są nieodpowiednie, należy rozważyć, czy hematologiczne i kliniczne biochemiczne zmiany powinny być określone przed rozpoczęciem dawkowania; zasadniczo nie jest zalecane, aby te dane były gromadzone przed traktowaniem (7).

1.5.2.3. Całościowa sekcja zwłok

Wszystkie zwierzęta w badaniu podlegają pełnej, szczegółowej całościowej sekcji zwłok, która obejmuje staranne badanie zewnętrznej powierzchni organu, wszystkie otwory i czaszkowe, piersiowe i brzuszne jamy i ich zawartości. Wątroba, nerka, nadnercza, jądra, najądrza, macica, jajniki, grasica, śledziona, mózg i serce wszystkich zwierząt (oddzielnie od tych, które okazały się konające i/lub zabite w międzyczasie) powinny być okrojone z wszelkich przylegających tkanek, odpowiednio, i należy tak szybko, jak to możliwe, pomierzyć ich mokrą wagę po sekcji w celu zapobieżenia wyschnięciu.

Następujące tkanki powinny być zakonserwowane w najwłaściwym środku utrwalającym dla obu typów tkanek i zamierzonych kolejnych badań histopatologicznych: wszystkie całkowite uszkodzenia, mózg (reprezentatywne obszary, włączając płaszcz mózgu, móżdżek i szpik/mostek), rdzeń kręgowy (na trzech poziomach: karkowym, środkowo-piersiowym i lędźwiowym), przysadka, tarczyca, przytarczyczka, grasica, przełyk, gruczoły ślinowe, żołądek, małe i duże jelita (włączając plamy Peyera), wątroba, trzustka, nerki, nadnercza, śledziona, serce, tchawica i płuca (zabezpieczone przez inflację utrwaloną, a następnie zanurzoną), aorta, gonady, macica, dodatkowe organy płciowe, żeńskie gruczoły sutkowe, prostata, pęcherz moczowy, pęcherzyk żółciowy (mysz), węzły limfatyczne (najlepiej jeden węzeł pokrywający drogę podawania i drugi odległy od drogi podawania, aby objąć działania na układ), nerw peryferyjny (kulszowy lub piszczelowy) zalecany w dużej bliskości od mięśnia, fragment kości szpikowej (i/lub świeża kość z zassanym szpikiem), skóra i oczy (jeśli zaobserwowano zmiany podczas badań oftalmologicznych). Kliniczne i inne wyniki badań mogą zasugerować konieczność zbadania dodatkowych tkanek. Także jakiekolwiek organy uznane za mogące być celem na podstawie znanych właściwości badanej substancji powinny być zakonserwowane.

1.5.2.4. Histopatologia

Pełna histopatologia powinna być przeprowadzona na zakonserwowanych ciałach i tkankach wszystkich zwierząt z grupy kontrolnej i wysokodawkowanej. Badania te powinny być rozciągnięte na wszystkie inne dawkowane grupy, jeśli w wysokodawkowanej grupie obserwuje się zmiany związane z działaniem środka.

Należy przebadać wszystkie zmiany patologiczne.

Jeśli używa się grupy satelickiej, histopatologia powinna być przeprowadzona na tkankach i ciałach, określonych jako wykazujące działanie, w grupach traktowanych.

2. DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ

2.1. DANE

Należy przedstawić dane osobnika. Dodatkowo, wszystkie dane powinny być zestawione w postaci tabelarycznej, przedstawiając w odniesieniu do każdej badanej grupy liczbę zwierząt na początku badania, liczbę zwierząt, które poniosły śmierć podczas trwania badania lub które zabito z przyczyn humanitarnych, wraz z czasem, w którym nastąpiła śmierć, lub humanitarnego zabicia, liczbę wykazującą oznaki zatrucia, opis obserwowanych oznak zatrucia, włączając czas zaistnienia, czas trwania, stopień ciężkości każdego działania toksycznego, liczbę zwierząt wykazującą zmiany patologiczne, typ zmian patologicznych i procent zwierząt obrazujący każdy typ zmiany patologicznej.

Gdy ma to zastosowanie, wyniki liczbowe powinny być szacowane właściwymi i ogólnie przyjętymi metodami statystycznymi. Metody statystyczne i dane poddawane analizie powinny być wybrane w czasie przygotowania projektu badań.

2.2. SPRAWOZDANIE Z BADANIA

Sprawozdanie dotyczące badań musi zawierać następujące informacje:

2.2.1. Substancja użyta w badaniu:

- charakter fizyczny, czystość i właściwości fizykochemiczne,

- dane identyfikacyjne,

- nośnik (jeśli jest to stosowne): uzasadnienie wyboru nośnika, jeśli jest różny od wody.

2.2.2. Gatunki użyte w badaniu:

- użyte gatunki i szczep,

- ilość, wiek i płeć zwierząt,

- źródło, warunki zamieszkiwania, pokarm itp.,

- waga osobnicza zwierząt przy rozpoczęciu badania.

2.2.3. Warunki badania:

- racjonalne uzasadnienie wybranego poziomu dawkowania,

- szczegółowe informacje dotyczące składu badanej substancji/przygotowanie pokarmu, uzyskane stężenie, stabilność i jednorodność przygotowania,

- szczegółowe informacje dotyczące podawania substancji badanej,

- dawka rzeczywista (mg/kg ciała waga/dzień), wskaźnik konwersji pokarm/woda pitna stężenia badanej substancji (ppm) do dawki rzeczywistej, jeśli ma to zastosowanie,

- szczegółowe informacje dotyczące jakości żywności i wody.

2.2.4. Wyniki:

- waga ciała oraz zmiany wagi ciała,

- spożycie żywności i wody, jeśli ma to zastosowanie,

- dane reakcji na zatrucie według płci i poziomu dawki, włączając oznaki zatrucia,

- charakter, surowość i czas trwania obserwacji klinicznych (stan odwracalny czy nie),

- wyniki badania oftalmologicznego,

- ocena czynności sensorycznych, siły zacisku i czynności motorycznych (gdy jest to dostępne),

- badania hematologiczne z odpowiednimi wartościami poziomów tolerancji,

- biochemiczne badania kliniczne z odpowiednimi wartościami poziomów tolerancji,

- końcowa waga ciała, waga organów i proporcje wagi organ/ciało,

- ustalenia sekcji zwłok,

- szczegółowy opis wszystkich histopatologicznych wyników badań,

- dane dotyczące absorpcji, jeśli jest to dostępne,

- statystyczne opracowywanie wyników, tam gdzie jest to stosowne;

Omówienie wyników.

Wnioski.

3. BIBLIOGRAFIA

(1) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No 60.

(2) Tupper, D. E., Wallace, R. B. (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, pp. 999-1003.

(3) Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, pp. 691-704.

(4) Moser, V. C., Mc Daniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol., 108, pp. 267-283.

(5) Meyer O. A., Tilson H. A., Byrd W. C., Riley M. T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limb grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, pp. 233-236.

(6) Crofton K. M., Howard J. L., Moser V. C., Gill M. W., Reiter L. W., Tilson H. A., MacPhail R. C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, pp. 599-609.

(7) Weingand K., Brown G., Hall R. et al. (1996). "Harmonisation of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies", Fundam. & Appl. Toxicol., 29, pp. 198-201.

⁽¹⁾ W odniesieniu do niektórych oznaczeń w surowicy i plazmie, najbardziej znacząco dla glukozy, zaleca się niekarmienie przez noc. Główną przyczyną tego zalecenia jest wzrost zmienności, który nieuchronnie powstaje przy nieprzestrzeganiu tego zalecenia i powoduje tendencję maskowania bardziej subtelnych efektów, co czyni interpretacje wyników trudną. Z drugiej strony jednak, niekarmienie przez noc może zakłócać ogólny metabolizm zwierząt, w szczególności w badaniach żywieniowych, może przeszkadzać w dziennej ekspozycji na działanie substancji badanej. Jeśli przyjęto metodę niekarmienia przez noc, kliniczne oznaczenia biochemiczne muszą być wykonane po wprowadzeniu do badań uwag funkcjonalnych.

ZAŁĄCZNIK 5E

B.27. BADANIE TOKSYCZNOŚCI PODPRZEWLEKŁEJ DROGĄ POKARMOWĄ BADANIA TOKSYCZNOŚCI NA NIEGRYZONIACH METODĄ POWTARZANEJ 90-DNIOWEJ DAWKI DROGĄ POKARMOWĄ

1. METODA

Niniejsza metoda badania toksyczności podprzewlekłej drogą pokarmową jest kopią OECD TG 409 (1998).

1.1. WPROWADZENIE

Przy oszacowaniu i ocenie cech toksyczności substancji chemicznej oznaczenie podprzewlekłej toksyczności drogą pokarmową, stosując powtarzane dawki, może być prowadzone po początkowej informacji o toksyczności, uzyskanej z 28-dniowych badań toksyczności ostrej lub powtarzanej. 90-dniowe badanie dostarcza informacji o możliwym niebezpieczeństwie dla zdrowia, które prawdopodobnie powstanie z powtarzanego narażenia przez okres szybkiego rozwoju do wczesnej dorosłości. Badanie dostarczy informacji na temat głównych toksycznych działań, wskaże zaatakowane organy i możliwości akumulacji, dostarczy oceny poziomu ekspozycji nie powodującego negatywnych skutków, którą stosuje się przy wyborze poziomów dawki dla badań przewlekłych i ustalania kryteriów bezpieczeństwa dla narażenia ludzi.

Metoda badania umożliwia określenie u gatunków należących do niegryzoni negatywnych skutków ekspozycji na działanie chemiczne oraz powinna być wykorzystywana tylko:

- w przypadku, gdy skutki zaobserwowane w innych badaniach wymagają wyjaśnienia/charakterystyki dla drugiego gatunku niegryzoni, lub

- w przypadku, gdy badania toksykokinetyczne wskazują, że wykorzystanie właściwego gatunku niegryzoni jest najbardziej trafnym wyborem ze zwierząt laboratoryjnych, lub

- w przypadku gdy inne właściwe przyczyny usprawiedliwiają wykorzystanie gatunku niegryzoni.

Patrz także ogólne wprowadzenie, część B.

1.2. DEFINICJE

Dawkowanie: jest ogólnym pojęciem obejmującym dawkę, jej częstotliwość i czas podawania dawki.

NOAEL: jest skrótem od poziomu, przy którym nie obserwuje się niekorzystnych skutków, oraz jest najwyższym poziomem dawki, gdzie nie obserwuje się niekorzystnych efektów zależnych od podawanej substancji.

1.3. ZASADA METODY BADANIA

Substancja badana jest codziennie podawana doustnie w stopniowanych dawkach, kilku grupom zwierząt doświadczalnych, jeden poziom dawki na grupę przez okres 90 dni. W czasie okresu podawania zwierzęta są ściśle obserwowane na oznaki zatrucia. Zwierzęta, które zmarły lub zostały zabite w czasie trwania badania są poddawane sekcji zwłok po zakończeniu badania, zwierzęta, które przeżyły, są również zabijane i poddawane sekcji zwłok.

1.4. OPIS METODY BADANIA

1.4.1. Dobór gatunków zwierząt

Zwykle wykorzystywanym gatunkiem niegryzoni jest pies, który powinien być określonej rasy; często wykorzystywany jest pies gończy. Inne gatunki, np. małe świnie, mogą być również wykorzystane. Naczelne nie są zalecane, a ich wykorzystanie powinno być uzasadnione. Powinny być wykorzystane młode, zdrowe zwierzęta, a w przypadku psa wskazane jest rozpoczęcie dawkowania w wieku 4-6 miesięcy i nie późniejszym niż dziewięć miesięcy. W przypadku gdy badanie jest prowadzone jako wstępne do badań toksyczności przewlekłej długoterminowej, w obu badaniach należy wykorzystać ten sam gatunek/rasę.

1.4.2. Przygotowanie zwierząt

Powinny być wykorzystane zdrowe zwierzęta, zaaklimatyzowane w warunkach laboratoryjnych i nie będące przedmiotem wcześniejszych procedur eksperymentalnych. Czas trwania aklimatyzacji zależy od wybranych gatunków badanych i ich źródła pochodzenia. Zalecane jest przynajmniej pięć dni w odniesieniu do psów albo celowo hodowanej trzody od rezydenta kolonii i co najmniej dwa tygodnie w odniesieniu do zwierząt z zewnętrznych źródeł. Zwierzęta badane powinny charakteryzować się gatunkiem, szczepem, źródłem, płcią, wagą i/lub wiekiem. Zwierzęta powinny być losowo wyznaczane do doświadczeń kontrolnych i grup traktowanych. Klatki powinny być rozmieszczone w sposób, aby możliwy wpływ wynikający z ich umieszczania był zminimalizowany. Każde zwierzę musi być oznakowane niepowtarzalnym numerem identyfikacyjnym.

1.4.3. Przygotowanie dawek

Substancja badana jest podawana w postaci pokarmu lub wody pitnej, przez zgłębnik lub w kapsułkach. Metoda podawania drogą pokarmową jest zależna od celu badania oraz właściwości fizykochemicznych badanego materiału.

Tam gdzie jest to konieczne, badaną substancję rozpuszcza się lub wykonuje zawiesinę w odpowiednim nośniku. Zalecane jest, aby tam, gdzie to jest możliwe, rozważyć wpierw użycie roztworu lub zawiesiny wodnej, a następnie rozważyć wykonanie roztworu/zawiesiny w oleju (np. w oleju kukurydzianym) i dopiero następnie w innych nośnikach. Dla nośników różnych od wody, muszą być znane cechy toksyczności. Powinna być określona stabilność badanej substancji w warunkach podawania dawek.

1.5. PROCEDURA

1.5.1. Ilość i płeć zwierząt

Co najmniej osiem zwierząt (cztery samice i cztery samce) należy wykorzystać w odniesieniu do każdego poziomu dawki. Jeśli planuje się zabijanie w trakcie, liczba powinna być zwiększona o przewidzianą ilość zwierząt do zabicia przed zakończeniem badań. Liczba zwierząt na końcu badania musi być odpowiednia do celów wnikliwego oszacowania toksycznych skutków. Na podstawie uprzedniej znajomość substancji lub bliskiego odpowiednika należy rozważyć włączenie dodatkowej, satelickiej grupy ośmiu zwierząt (po cztery każdej płci) do grupy kontrolnej i grupy najwyżej dawkowanej do celów obserwacji po okresie czasu traktowania, odwracalności lub trwałości jakichkolwiek skutków toksycznych. Czas trwania tego okresu po traktowaniu powinien być ustalony odpowiednio w odniesieniu do obserwowanych skutków.

1.5.2. Poziomy dawek

Stosuje się co najmniej trzy poziomy dawek i równoczesne doświadczenie kontrolne, poza przypadkiem gdy prowadzone jest badanie graniczne (patrz ppkt 1.5.3). Poziomy dawek mogą być oparte na wynikach powtarzanej dawki lub badaniach ustalania zakres oraz powinny uwzględniać wszelkie istniejące dane toksykologiczne i toksykokinetyczne, dostępne w odniesieniu do badanej substancji lub związanych z nią materiałów. Poza ograniczeniami natury fizykochemicznej i działaniami biologicznymi substancji badanej poziom najwyższej dawki musi być wybrany w celu wzbudzenia objawów toksycznych, ale nie spowodowania śmierci czy też poważnych cierpień. Opadająca sekwencja poziomu dawki musi być wybrana w celu pokazania reakcji związanej z dawkowaniem i poziomem, przy którym nie obserwuje się negatywnych skutków (NOAEL) przy najniższym poziomie dawki. Dwa do czterech zachodzące przedziały są często optymalne do ustalenia opadających poziomów dawki i dodanie czwartej grupy badanej jest często polecane dla zastosowania bardzo dużych odstępów (np. więcej niż współczynnik 6-10) między dawkowaniami.

Grupa kontrolna musi być grupą nietraktowaną lub grupą kontrolną nośnika, jeśli nośnik jest używany do podawania substancji badanej. Zwierzęta w grupie kontrolnej, poza nietraktowaniem jej substancją badaną, są obsługiwane w identyczny sposób, jak w zwierzęta w grupach badanych. Jeśli stosowany jest nośnik, grupa kontrolna musi otrzymywać nośnik w maksymalnie stosowanej objętości. Gdy substancja badana jest podawana w diecie i powoduje zmniejszenie zapotrzebowania żywieniowego, wtedy grupa kontrolna z pary żywieniowej może być pomocna w rozróżnieniu między zmniejszeniem spowodowanym odczuwaniem smaku lub zmianami toksykologicznymi w modelu badania.

1.5.3. Badanie graniczne

Jeśli badanie przy jednym poziomie dawki równoważnym co najmniej 1.000 mg/kg masy ciała/dzień, stosując procedurę opisaną w odniesieniu do niniejszego badania, powoduje, że nie obserwuje się negatywnych skutków, oraz jeśli nie oczekuje się toksyczności na podstawie danych substancji strukturalnie związanych, wtedy pełne badania z zastosowaniem trzech poziomów nie wydają się konieczne. Badanie graniczne ma zastosowanie, z wyjątkiem sytuacji, gdy narażenie ludzi wskazuje potrzebę zastosowania wyższego poziomu dawki.

1.5.4. Podawanie dawek

Zwierzętom dozuje się substancję badaną przez siedem dni każdego tygodnia w okresie 90 dni. Każdy inny sposób dozowania, na przykład pięć dni w tygodniu, wymaga uzasadnienia. Gdy substancja badana jest podawana przez zgłębnik, musi być to wykonane w pojedynczej dawce, przy użyciu sondy przełykowej lub odpowiedniej kaniuli intubacyjnej. Maksymalna objętość cieczy, która może być podana w jednym momencie, zależy od rozmiarów zwierzęcia badanego. Objętość nie może przekraczać 1 ml/100 g masy ciała, poza przypadkiem wodnych roztworów, gdzie można zastosować 2 ml/100 g masy ciała. Z wyjątkiem substancji drażniących i żrących, które zwykle ujawniają silniejsze działanie przy wyższym stężeniu, zmienności w objętości badanej muszą być zminimalizowane przez ustawienie stężenia tak, aby zapewnić stałą objętość we wszystkich poziomach dozowania.

W odniesieniu do substancji podawanych w pokarmie lub wodzie pitnej istotne jest zapewnienie, aby ilości danej substancji badanej nie kolidowały z normalnym odżywianiem lub równowagą wodną. Gdy substancja badana jest podawana w pokarmie - w stałym stężeniu w pokarmie (ppm) albo w stałym poziomie dawki - może być zastosowana w odniesieniu do masy ciała zwierzęcia, wykorzystana alternatywa musi być określona. W odniesieniu do substancji podawanej przez zgłębnik dawka musi być podana w podobnej porze każdego dnia i regulowana tak, by utrzymać stały poziom dawki w odniesieniu do masy ciała zwierzęcia. W przyadku gdy badanie 90-dniowe jest stosowane jako wstępne do badań długoterminowych toksyczności przewlekłej, w obu badaniach powinien być użyty podobny pokarm.

1.5.5. Obserwacje

Ogólne kliniczne obserwacje powinny być dokonywane przynajmniej raz na dzień, najlepiej o tej(tych) samej(-ych) porze (porach) każdego dnia, uwzględniając szczytowy okres przewidywanego działania po dozowaniu. Stan kliniczny zwierząt powinien być rejestrowany. Co najmniej dwa razy dziennie, zwykle na początku i pod koniec każdego dnia, wszystkie zwierzęta są kontrolowane w zakresie oznak zachorowań i śmiertelności.

Przynajmniej raz, przed pierwszą ekspozycją (uwzględnić w granicach porównania), i raz tygodniowo później należy dokonać szczegółowej obserwacji klinicznej na wszystkich zwierzętach. Obserwacje te powinny być dokonywane poza klatką domową, najlepiej w warunkach standardowych za każdym razem w podobnych porach. Powinny one być starannie zapisane, najlepiej przez zastosowanie systemów punktacji, wyraźnie określonych przez laboratorium badawcze. Należy dołożyć starań w celu zapewnienia, aby zmiany w warunkach obserwacji były minimalne. Oznaki zauważone powinny obejmować zmiany na skórze, futrze, oczach, błonach śluzowych, występowania wydzielin i czynności autonomiczne (np. łzawienie, piloerekcja, rozmiar źrenic, zmieniony rytm oddychania), lecz nie powinny być ograniczone tylko do nich. Zmiany w chodzie, postawie i reakcja na obchodzenie się, jak również obecność zachowań klonicznych i tonicznych, stereotypów (np. nadmierne zajmowanie się sobą, kołowacizna) lub dziwaczne zachowanie (np. samookaleczanie, chodzenie wstecz) także muszą być zarejestrowane.

Badanie oftalmologiczne przy użyciu oftalmoskopu lub równoważnego odpowiedniego przyrządu musi być wykonane przed podawaniem dawek badanej substancji i przy ukończeniu badań, najlepiej na wszystkich zwierzętach, ale przynajmniej w grupach wysokiej dawki i kontrolnej. Jeśli wykryto zmiany w oczach, należy przebadać wszystkie zwierzęta.

1.5.5.1. Waga ciała i i spożycie pokarmu/wody

1.5.5.2. Biochemia kliniczna i hematologia

Hematologia, włączając: hematokryt, stężenie hemoglobiny, liczbę erytrocytów, całkowitą i różnicową liczbę leukocytów, liczbę płytek krwi i pomiar potencjału krzepliwości, takiego jak czas krzepliwości, czas protrombinowy i tromboplastynowy, powinna być zbadana na początku badania, następnie albo w odstępach miesięcznych, albo w środku okresu badania oraz ostatecznie pod koniec okresu badania.

Oznaczenia biochemii klinicznej do badań głównych skutków toksycznych w tkankach, w szczególności działań na nerki i wątrobę, powinny być wykonane na próbkach krwi, uzyskanych od każdego zwierzęcia na początku, następnie albo w odstępach miesięcznych, albo w środku okresu badania oraz ostatecznie pod koniec okresu badania. Dziedzinami badań, które muszą być rozważone, są równowaga elektrolitów, metabolizm węglowodanów oraz funkcje wątroby i nerek. Na wybór specyficznych badań wpływają obserwacje sposobu działania substancji badanej. Zwierzęta powinny być przetrzymane przez okres odpowiedni do gatunku przed pobieraniem próbek krwi. Zalecane oznaczenia obejmują wapń, fosfor, chlorki, sód, potas, glukozę, aminotransferazę alaninową, aminotransferazę asparaginową, dekarboksylazę ornityny, gammę glutamylową, transpeptydazę, azot mocznikowy, albuminy, kreatyninę krwi, całkowitą bilirubinę i całkowitą surowicę białkową.

Oznaczenia analityczne w moczu powinny być wykonane przynajmniej na początku, następnie w środku i pod koniec badania, stosując zebraną czasowo objętość moczu. Oznaczenia moczu obejmują przejrzystość, objętość, osmolality lub ciężar właściwy, pH, białka, glukozę i komórki krwi. Inne parametry dodatkowo mogą być oznaczane w miarę potrzeby rozszerzenia badania zaobserwowanych skutków.

Ponadto należy rozważyć zastosowanie do badań surowicy znaczników ogólnego uszkodzenia tkanek. Inne oznaczenia, które mogą być niezbędne do odpowiedniej oceny toksykologicznej, obejmują lipidy, hormony, równowagę kwasowo-zasadową, metahemoglobinę, inhibitory cholinoesterazy. Dodatkowe badania kliniczne mogą być wykorzystywane, gdy niezbędne jest rozszerzenie badania zaobserwowanych skutków. Mogą być one potrzebne do określenia niektórych związków chemicznych w niektórych klasach lub na zasadzie jednostkowych przypadków.

Ogólnie, potrzebne jest elastyczne podejście, w zależności od gatunku oraz obserwowanych i/lub spodziewanych skutków pochodzących od danej substancji.

1.5.5.3. Całościowa sekcja zwłok

Wszystkie zwierzęta w badaniu podlegają pełnej, szczegółowej brutto sekcji zwłok, która obejmuje staranne badanie zewnętrznej powierzchni organu, wszystkie otwory i czaszkowe, piersiowe i brzuszne jamy i ich zawartości. Wątroba, nerka, nadnercza, jądra, najądrza, macica, jajniki, grasica, śledziona, mózg i serce wszystkich zwierząt (oddzielnie od tych, które okazały się konające i/lub zabite w międzyczasie) powinny być okrojone z wszelkich przylegających tkanek, odpowiednio, i należy tak szybko, jak to możliwe, pomierzyć ich mokrą wagę po sekcji w celu zapobieżenia wyschnięciu.

Następujące tkanki powinny być zakonserwowane w najwłaściwszym środku utrwalającym dla obu typów tkanek i zamierzonych kolejnych badań histopatologicznych: wszystkie całokowite uszkodzenia, mózg, (reprezentatywne obszary, włączając płaszcz mózgowy, móżdżek i szpik/mostek), rdzeń kręgowy (na trzech poziomach: karkowym, środkowo-piersiowym i lędźwiowym), przysadka, tarczyca, przytarczyczka, grasica, przełyk, gruczoły ślinowe, żołądek, małe i duże jelita (włączając plamy Peyera), wątroba, trzustka, nerki, nadnercza, śledziona, serce, tchawica i płuca (zabezpieczone przez inflację utrwaloną, a następnie zanurzoną), aorta, gonady, macica, dodatkowe organy płciowe, żeńskie gruczoły sutkowe, prostata, pęcherz moczowy, pęcherzyk żółciowy (mysz), węzły limfatyczne (najlepiej jeden węzeł pokrywający drogę podawania i drugi odległy od drogi podawania, aby objąć działania na układ), nerw peryferyjny (kulszowy lub piszczelowy) zalecany w dużej bliskości od mięśnia, fragment kości szpikowej (i/lub świeża kość z zassanym szpikiem), skóra i oczy (jeśli zaobserwowano zmiany podczas badań oftalmologicznych). Kliniczne i inne wyniki badań mogą zasugerować konieczność zbadania dodatkowych tkanek. Także jakiekolwiek organy uznane za mogące być celem na podstawie znanych właściwości badanej substancji powinny być zakonserwowane.

1.5.5.4. Histopatologia

Należy przebadać wszystkie zmiany patologiczne.

Jeśli używa się grupy satelickiej, histopatologia powinna być przeprowadzona na tkankach i ciałach, określonych jako wykazujące działanie, w grupach traktowanych.

2. DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ

2.1. DANE

Gdy ma to zastosowanie, wyniki liczbowe powinny być szacowane właściwymi i ogólnie przyjętymi metodami statystycznymi. Metody statystyczne i dane poddawane analizie, powinny być wybrane w czasie przygotowania projektu badań.

2.2. SPRAWOZDANIE DOTYCZĄCE BADAŃ

Sprawozdanie dotyczące badań musi zawierać następujące informacje:

2.2.1. Substancja użyta w badaniu:

- charakter fizyczny, czystość i właściwości fizykochemiczne,

- dane identyfikacyjne,

- nośnik (jeśli jest to stosowne): uzasadnienie wyboru nośnika, jeśli jest różny od wody.

2.2.2. Gatunki użyte w badaniu:

- użyte gatunki i szczep,

- ilość, wiek i płeć zwierząt,

- źródło, warunki zamieszkiwania, pokarm itp.,

- waga osobnicza zwierząt przy rozpoczęciu badania.

2.2.3. Warunki badania:

- racjonalne uzasadnienie wybranego poziomu dawkowania,

- szczegółowe informacje dotyczące składu badanej substancji/przygotowanie pokarmu, uzyskane stężenie, stabilność i jednorodność przygotowania,

- szczegółowe informacje dotyczące podawania substancji badanej,

- dawka rzeczywista (mg/kg ciała waga/dzień), wskaźnik konwersji pokarm/woda pitna stężenia badanej substancji (ppm) do dawki rzeczywistej, jeśli ma to zastosowanie,

- szczegółowe informacje dotyczące jakości żywności i wody.

2.2.4. Wyniki:

- waga ciała oraz zmiany wagi ciała,

- spożycie żywności i wody, jeśli ma to zastosowanie,

- dane reakcji na zatrucie według płci i poziomu dawki, włączając oznaki zatrucia,

- charakter, surowość i czas trwania obserwacji klinicznych (stan odwracalny czy nie),

- wyniki badania oftalmologicznego,

- ocena czynności sensorycznych, siły zacisku i czynności motorycznych (gdy jest to dostępne),

- badania hematologiczne z odpowiednimi wartościami poziomów tolerancji,

- biochemiczne badania kliniczne z odpowiednimi wartościami poziomów tolerancji,

- końcowa waga ciała, waga organów i proporcje wagi organ/ciało,

- ustalenia sekcji zwłok,

- szczegółowy opis wszystkich histopatologicznych wyników badań,

- dane dotyczące absorpcji, jeśli jest to dostępne,

- statystyczne opracowanie wyników, tam gdzie jest to stosowne;

Omówienie wyników.

Wnioski.

ZAŁĄCZNIK 5F

C.14. BADANIE ROZWOJU MŁODYCH RYB

1. METODA

Niniejsza metoda wpływu toksyczności na rozwój jest kopią OECD TG 215 (2000).

1.1. WPROWADZENIE

Niniejszy badanie jest przeznaczone do oceny skutków przedłużonej ekspozycji na działanie substancji chemicznych na rozwój młodocianych ryb. Opiera się na metodzie rozwiniętej i powszechnie stosowanej (1) (3) w ramach Unii Europejskiej dla oceny działania substancji chemicznych na rozwój młodego pstrąga tęczowego (Oncorynchus mykiss) w warunkach przepływowych. Inne dobrze udokumentowane gatunki można również zastosować. Na przykład uzyskano doświadczenie z badań rozwoju danio pręgowanego (Danio rerio) (2) (4) (5) i Oryzias latipes (6) (7) (8).

Patrz także ogólne wprowadzenie, część C.

1.2. DEFINICJE

Najniższy obserwowany skutek stężenia (LOEC): jest to najmniejsze badane stężenie substancji badanej, przy którym obserwuje się znaczący skutek (przy p < 0,05) w porównaniu z doświadczeniem kontrolnym. Jednakże wszystkie badane stężenia powyżej LOEC muszą wykazywać szkodliwy skutek, równy lub większy niż ten obserwowany przy LOEC.

Nieobserwowany skutek stężenia (NOEC): jest stężeniem badanym bezpośrednio poniżej LOEC.

EC_x: w niniejszej metodzie jest stężeniem badanej substancji, która powoduje x% zmienności we wskaźniku rozwoju ryb w porównaniu z doświadczeniem kontrolnym.

Wskaźnik obciążenia: jest wilgotną masą ryb na objętość wody.

Gęstość wyjściowa: jest liczbą ryb do objętości wody.

Wskaźnik szczególnego rozwoju określonej ryby: wyrażenie wskaźnika rozwoju określonej jednostki na podstawie jej początkowej wagi.

Średni zbiornikowy wskaźnik szczególnego rozwoju: wyrażenie średniego wskaźnika wzrostu populacji w zbiorniku przy jednym stężeniu.

Wskaźnik pseudoszczególnego rozwoju: wyrażenie wskaźnika określonego rozwoju w proporcji do średniej wagi początkowej populacji zbiornika.

1.3. ZASADA METODY BADANIA

Młode ryby w fazie wykładniczej rozwoju są umieszczane po zważeniu w komorach do badań i eksponowane w zakresie stężenia subletalnego substancji badanej rozpuszczonej najlepiej strumieniem wody lub, jeśli to niemożliwe, we właściwych, półstatycznych (statycznie odnawialnych) warunkach. Czas trwania badania wynosi 28 dni. Ryby są karmione codziennie. Racje żywności są oparte na początkowej wadze ryb i przeliczane po 14 dniach. Na koniec badania ryby są ważone ponownie. Skutki w odniesieniu do wskaźników rozwoju są analizowane z zastosowaniem modelu regresyjnego w celu prognozowania stężenia, które spowoduje x% zmienności we wskaźniku rozwoju, tj. EC_x (np. EC₁₀, EC₂₀, lub EC₃₀). Alternatywnie dane są porównywane z objętością w doświadczeniu kontrolnym w celu ustalenia najniższego obserwowanego skutku stężenia (LOEC), a stąd też nieobserwowanego skutku stężenia (NOEC).

1.4. INFORMACJE DOTYCZĄCE SUBSTANCJI BADANEJ

Wyniki badania ostrej toksyczności (patrz metoda badania C.1) najlepiej przeprowadzona z gatunkami wybranymi do niniejszego badania, powinny być dostępne. Oznacza to, że rozpuszczalność w wodzie i ciśnienie pary badanej substancji są znane, a wiarygodna analityczna metoda jest dostępna w odniesieniu do ujęcia ilościowego substancji w roztworach badanych, ze znaną i udokumentowaną dokładnością oraz granicą wykrywalności.

Użyteczne informacje obejmują wzór strukturalny, czystość substancji, stabilność w wodzie i na świetle, pK_a, P_ow oraz wyniki badania całkowitej biodegradacji (patrz metoda C.4).

1.5. WAŻNOŚĆ BADANIA

Aby badanie był ważne, stosuje się następujące warunki:

- śmiertelność w doświadczeniach kontrolnych nie może przekraczać 10% na koniec badania,

- średnia waga ryb w doświadczeniach kontrolnych musi wzrosnąć wystarczająco, aby pozwolić na wykrycie minimalnych zmian wskaźnika rozwoju uznanego za znaczący. Próba pierścieniowa (3) wykazała, że w odniesieniu do pstrąga tęczowego średnia waga ryb w doświadczeniach kontrolnych wzrosła co najmniej o połowę (tj. 50%) ich średniej wagi początkowej przez ponad 28 dni, tj. waga początkowa: 1 g/ryba (= 100%), waga końcowa po 28 dniach: ≥ 1,5 g/ryba (≥ 150%),

- stężenie tlenu rozpuszczonego musi wynosić co najmniej 60% wartości nasycenia powietrzem (ASV) w trakcie badania,

- różnica temperatury wody nie może być większa niż ± 1°C między komorami do badań przez cały czas trwania badania i musi być utrzymywana w obrębie 2° C zakresu temperatur określonego w odniesieniu do gatunków badanych (dodatek 1).

1.6. OPIS METODY BADANIA

1.6.1. Aparatura

Zwykły sprzęt laboratoryjny, w szczególności następujący:

a) mierniki tlenu i pehametry;

b) sprzęt do oznaczania alkaliczności i twardości wody;

c) odpowiednia aparatura do pomiaru temperatury, zalecane jest stałe monitorowanie;

d) zbiorniki wykonane z chemicznie obojętnego materiału o odpowiedniej objętości, w zależności do zalecanej gęstości wyjściowej i obciążenia (patrz ppkt 1.8.5 i dodatek 1);

e) waga o odpowiedniej dokładności (tj. dokładności do ± 0,5%).

1.6.2. Woda

Każda woda, w której badane gatunki wykazują odpowiednie długoterminowe przeżycie i wzrost, może być stosowana jako woda do badań. Musi być stałej jakości w okresie trwania badania. Wartość pH wody powinna być w zakresie 6,5-8,5, lecz w trakcie danego badania musi być w zakresie ± 0,5 pH. Twardość powyżej 140 mg/l (jako CaCO₃) jest zalecana. W celu zapewnienia, aby rozcieńczająca woda nie miała falowego wpływu na wyniki badania (np. przez kompleksowanie substancji badanej), należy okresowo pobierać próbki wody do analizy. Co trzy miesiące na przykład powinny być wykonane pomiary metali ciężkich (takich jak Cu, Pb, Zn, Hg, Cd i Ni), głównych anionów i kationów (np. Ca, Mg, Na, K, Cl i SO₄), pestycydów (np. całkowita ilość fosforo- i chloroorganicznych), całkowity węgiel organiczny i zawiesina ciał stałych, w przypadku gdy rozcieńczająca woda jest znana jako stosunkowo stała w jakości. Jeśli można przedstawić dane, że jakość wody była stała przynajmniej przez rok, oznaczenia mogą być mniej częste i przedziały poszerza się (np. co sześć miesięcy). Kilka cech chemicznych akceptowalnej wody rozcieńczającej wymieniono w dodatku 2.

1.6.3. Roztwory użyte w badaniu

Roztwory w badaniu o wybranym stężeniu są przygotowywane poprzez rozcieńczanie roztworu podstawowego.

Zalecane jest przygotowanie roztworu podstawowego przez proste wymieszanie badanej substancji w wodzie rozcieńczającej w sposób mechaniczny (np. mieszadło lub ultradźwięki). Kolumny nasyceniowe (rozpuszczające) mogą być użyte do uzyskania odpowiednio stężonego roztworu podstawowego.

W kilku przypadkach może być wymagane użycie rozpuszczalników lub dyspergatorów (środków rozpuszczających) w celu wykonania odpowiednio stężonego roztworu podstawowego. Przykładami odpowiednich rozpuszczalników są aceton, etanol, metanol, dimetylosulfotlenek, dimetyloformamid i glikol trójetylenowy. Przykładami odpowiednich dyspergatorów są Cremophor RH40, Tween 80, Metyloceluloza 0,01% i HCO-40. Należy zachować ostrożność przy użyciu łatwo biodegradowalnych środków (np. aceton) i/lub wysokolotnych związków, gdyż mogą być przyczyną problemów z rozwojem bakterii w przepływach badań. Gdy stosuje się środki rozpuszczające, nie mogą one mieć znaczącego wpływu na wzrost ryb i widocznych negatywnych działań na młode ryby, jak odkryto w doświadczeniu kontrolnym z rozpuszczalnikiem.

Dla badań przepływowych wymagany jest system ciągłego dozowania i rozcieńczania roztworu podstawowego substancji badanej (np. pompa dozująca, rozcieńczalnik proporcjonalny, system nasycania) do przesyłania serii stężeń do komór do badań. Szybkości przepływów roztworu podstawowego i rozcieńczającej wody muszą być sprawdzane okresowo, najlepiej codziennie w trakcie trwania badania oraz nie mogą zmieniać się więcej niż 10% w trakcie badania. Badanie pierścieniowe (3) wykazało, że w odniesieniu do pstrąga tęczowego częstotliwość wymiany wody w trakcie trwania badania jest akceptowalna przy 6 litrów/g ryby/dzień (patrz ppkt 1.8.2.2).

Dla badań półstatycznych (odnawialnych) częstotliwość odnawiania ośrodka zależy od stabilności substancji badanej, lecz zalecane jest codzienne odnawianie wody. Jeśli ze wstępnych badań stabilności (patrz ppkt 1.4) wynika, że stężenie substancji badanej nie jest stabilne (tj. poza zakresem nominalnego 80-120% lub spada poniżej 80% zmierzonego stężenia początkowego) przez okres odnowienia, należy rozważyć celowość użycia badania przepływowego.

1.6.4. Wybór gatunków

Pstrąg tęczowy (Oncorhynchus mykiss) jest zalecanym gatunkiem do niniejszego badania, ponieważ uzyskano najwięcej doświadczeń z prób pierścieniowych z tym gatunkiem (1) (3). Można jednakże zastosować inne, dobrze udokumentowane gatunki, lecz może być niezbędne przyjęcie procedury badania w celu zapewnienia odpowiednich warunków badania. Dostępne są doświadczenia, na przykład z danio pręgowanym (Danio rerio) (4) (5) i Oryzias latipes (6) (7) (8). W takim przypadku powinno być podane racjonalne uzasadnienie wyboru i metody eksperymentalnej.

1.6.5. Przetrzymanie ryb

Badane ryby muszą być wybrane z populacji wyjściowej pojedynczo, najlepiej z tego samego tarła, przetrzymywanego co najmniej dwa tygodnie przed badaniem w warunkach jakości wody i oświetlenia zbliżonych do stosowanych w badaniu. Powinny one być karmione racją minimum 2% wagi ciała dziennie, a najlepiej 4% wagi ciała na dzień przez okres przetrzymania i w trakcie trwania badania.

Przez następujący od rozpoczęcia okres 48 godzin notowana jest śmiertelność i stosuje się następujące kryteria:

- śmiertelność większa niż 10% populacji przez siedem dni: odrzucić całą partię,

- śmiertelność między 5% i 10% populacji: aklimatyzacja przez siedem dodatkowych dni, jeśli więcej niż 5% śmiertelności w ciągu tych siedmiu dni, odrzucić całą partię,

- śmiertelność mniejsza od 5% populacji w ciągu siedmiu dni: dopuścić partię.

Ryby nie mogą być taktowane leczniczo przez dwa tygodnie poprzedzające badanie ani w ciągu jego trwania.

1.7. PROJEKT BADANIA

"Projekt badania" odnosi się do wyboru ilości i odstępów stężeń badanych, liczby zbiorników dla każdego poziomu i liczby ryb na zbiornik. W idealnym przypadku, taki projekt badania powinien być wybierany z uwzględnieniem:

a) celu badania;

b) metody statystycznej analizy, która będzie wykorzystana;

c) dostępności i źródła finansowania eksperymentu.

Oświadczenie o celu badania powinno, jeśli jest to możliwe, określać statystyczną zdolność, przy której różnica danego wymiaru (np. we wskaźniku rozwoju) wymaganego jest możliwa do obserwacji lub alternatywnie, precyzja z jaką EC_x (na przykład x = 10, 20, lub 30, a najlepiej nie mniej niż 10) ma być oszacowane. Bez tego zwięzłego określenie zakresu badania nie może być podane.

Istotne jest, aby uznać, że projekt, który jest optymalny (najlepszy z użyciem źródeł) przy użyciu jednej metody analizy statystycznej, nie jest koniecznie optymalny dla innej. Zalecany projekt dla oszacowania LOEC/NOEC dlatego nie byłby taki sam jak zalecany dla analizy metodą regresji.

W większości przypadków analiza regresyjna jest zalecana dla analizy wariancji, z przyczyn omówionych przez Stephan i Rogers (9). Jednakże jeżeli nie znaleziono odpowiedniego modelu regresji (r² < 0,9) powinna być zastosowana metoda NOEC/LOEC.

1.7.1. Projekt analizy regresyjnej

Ważnymi rozważaniami w projekcie badania, które mają być zanalizowane metodą regresyjną, są:

a) skutek stężenia (np. EC_10,20,30) i zakres stężeń, powyżej którego wpływ substancji badanej jest poza zainteresowaniem, powinien być koniecznie osiągnięty przez stężenie włączone do badań. Dokładność, z którą ocena wpływu stężenia jest wykonywana, jest najlepsza, gdy wpływ stężenia jest pośrodku zakresu badanych stężeń. Wstępne badanie szukania zakresu może być pomocne w wybraniu właściwych stężeń badanych;

b) w celu zapewnienia zadawalającego modelu statystycznego badanie powinno obejmować co najmniej jeden zbiornik kontrolny i pięć dodatkowych zbiorników o różnych stężeniach. Tam, gdzie to jest stosowne, gdy stosowany jest środek ułatwiający rozpuszczanie, należy przeprowadzić obok serii badanej jedno doświadczenie kontrolne z tym środkiem przy najwyższym badanym stężeniu (patrz ppkt 1.8.3 i 1.8.4);

c) właściwe serie geometryczne lub serie logarytmiczne (10) (patrz dodatek 3) mogą być wykorzystane. Zaleca się odstępy logarytmiczne w stężeniach badanych;

d) o ile jest dostępne więcej niż sześć zbiorników, dodatkowe zbiorniki muszą być użyte albo do zapewnienia powtórzenia lub rozdziału w poprzek zakresu stężeń, w celu zapewnienia bliższego odstępu poziomów. Oba z tych środków są w równym stopniu pożądane.

1.7.2. Projekt dotyczący oszacowania NOEC/LOEC przy użyciu analizy wariancji (ANOVA)

Zalecane jest posiadanie skopiowanych zbiorników dla każdego stężenia i analizy statystycznej na poziomie zbiornika (11). Bez skopiowanych zbiorników nie można zastosować poprawek dla zmienności między zbiornikami, poza spodziewanymi dla poszczególnych ryb. Jednakże doświadczenie pokazało (12), że zmienność między zbiornikami jest bardzo mała w porównaniu ze zmiennością w obrębie zbiorników (tj. między rybami) w badanym przypadku. Dlatego względnie dopuszczalną alternatywą jest przeprowadzenie analizy statystycznej na poziomie poszczególnych ryb.

Zwyczajowo stosuje się co najmniej pięć stężeń badanych w serii geometrycznej ze współczynnikiem zalecanym nieprzekraczającym 3,2.

Ogólnie, gdy badania są prowadzone ze skopiowanymi zbiornikami, liczba skopiowanych zbiorników kontrolnych, a zatem i liczba ryb musi być podwojona przy każdym badaniu stężenia, które powinny być równoważnych rozmiarów (13) (14) (15). Z drugiej strony, przy nieobecności skopiowanych zbiorników, liczba ryb w grupie kontrolnej powinna być taka sama jak liczba przy każdym badaniu stężenia.

Jeśli ANOVA ma opierać się na zbiornikach, a nie na poszczególnych rybach (pociąga to albo oznaczanie poszczególnych ryb, albo użycie pseudoszczególnych wskaźników rozwoju (patrz ppkt 2.1.2)), zachodzi potrzeba wystarczającego skopiowania zbiorników w celu zapewnienia oznaczenia standardowego odchylenia "stężeń w obrębie zbiorników". To oznacza, że stopień swobody błędu w analizie wariancji musi wynosić co najmniej 5 (11). Jeśli tylko doświadczenia kontrolne są powielane, zachodzi niebezpieczeństwo, że zmienność błędu będzie obciążona, ponieważ może to zwiększyć rozważaną wartość średnią wskaźnika rozwoju. Ponieważ wskaźnik rozwoju prawdopodobnie zmniejszy się ze wzrostem stężenia, będzie to powodowało przeszacowanie zmienności.

1.8. PROCEDURA

1.8.1. Wybór i ważenie ryb badanych

Istotne jest, aby zminimalizować zmienność wagi ryb na początku badania. Odpowiedni zakres wymiarowy dla różnych gatunków zalecanych do wykorzystania w tym badaniu podano w dodatku 1. W odniesieniu do całej partii ryb wykorzystanych w badaniu, zakres poszczególnych wag na początku badania powinien być idealnie utrzymany w obrębie ± 10% średniej arytmetycznej wagi, a w żadnym przypadku nie może przekraczać 25%. Zalecane jest zważenie podpróbki ryb przed badaniem w celu oszacowania średniej wagi.

Należy wstrzymać żywienie populacji na 24 godziny przed rozpoczęciem badania. Ryby powinny być wybrane losowo. Stosując ogólne znieczulenie (np. roztwór wodny 100 mg/l metanosulfonianu tricainy (MS 222) zneutralizowanej przez dodanie dwóch części dwuwęglanu sodu na jedną część MS 222), ryby powinny być zważone pojedynczo w stanie wilgotnym (osuszone) z dokładnością podaną w dodatku 1. Ryby, których waga jest w zamierzonym zakresie, powinny być zatrzymane i następnie losowo rozdzielone do zbiorników do badań. Całkowita waga ryb w każdym zbiorniku powinna być odnotowana. Użycie znieczulenia ułatwia manipulację rybami (włączając suszenie i ważenie), może jednak powodować stres i zranienia dla młodocianych ryb, w szczególności dla gatunków o małych wymiarach. Dlatego manipulowanie młodocianymi rybami musi być wykonane z najwyższą troską, aby zapobiec stresom i zranieniom badanych zwierząt.

Ryby są ważone ponownie w 28 dniu badania (patrz ppkt 1.8.6). Jednakże jeśli jest to uważane za niezbędne przeliczenie racji żywieniowej, ryby są ważone ponownie 14 dnia badania (patrz ppkt 1.8.2.3). Inne metody, takie jak metoda fotograficzna, mogą być stosowane do ustalania zmiany rozmiarów ryb, na podstawie których można dostosować racje żywieniowe.

1.8.2. Warunki ekspozycji

1.8.2.1. Czas trwania

Czas trwania badania wynosi ≥ 28 dni.

1.8.2.2. Wskaźnik obciążenia i gęstości wyjściowe

Istotne jest, aby wskaźnik obciążenia i gęstość wyjściowa były właściwe dla wykorzystanych gatunków badanych (patrz dodatek 1). Jeśli gęstość wyjściowa jest za wysoka, wtedy stres z powodu zatłoczenia może prowadzić do zmniejszenia wskaźnika rozwoju i prawdopodobnie do choroby. Jeśli jest za mała, może wytwarzać zachowywanie terytorialne, które również wpływa na rozwój. W każdym przypadku wskaźnik obciążenia powinien być wystarczająco niski, aby stężenie tlenu rozpuszczonego wynosiło przynajmniej 60% ASV i było utrzymywane bez napowietrzania. Próba pierścieniowa (3) pokazała, że w odniesieniu do pstrąga tęczowego wskaźnik obciążenia dla 16 pstrągów po 3-5 gramów w 40-litrowej objętości jest dopuszczalny. Zalecana częstotliwość usuwania wody w czasie trwania badania wynosi 6 litrów/gram ryby/dzień.

1.8.2.3. Karmienie

Ryby muszą być karmione właściwym pokarmem (dodatek 1) w wystarczającej ilości dla wytworzenia akceptowalnego wskaźnika rozwoju. Należy zwrócić uwagę, aby zapobiec rozwojowi mikrobów i mętności wody. Dla pstrąga tęczowego, wskaźnik 4% ich wagi ciała dziennie prawdopodobnie spełnia te warunki (3) (16) (17) (18). Dzienna racja może być podzielona na dwie równe porcje i podawana rybom w dwóch posiłkach dziennie, w odstępie co najmniej pięciu godzin. Racje są oparte na początkowej całkowitej wadze ryb w każdym zbiorniku do badań. Jeśli ryby są ważone ponownie 14 dnia, racje są wtedy przeliczane. Karmienie powinno być wstrzymane na 24 godziny przed ważeniem.

Niezjedzony pokarm i odchody ryb muszą być usuwane ze zbiorników do badań codziennie, poprzez staranne czyszczenie dna zbiorników, stosując ssanie.

1.8.2.4. Światło i temperatura

Czas naświetlania i temperatura wody muszą być odpowiednie dla badanego gatunku (dodatek 1).

1.8.3. Stężenia użyte w badaniu

Zwykle wymagane jest pięć stężeń badanych, poza projektem badania (patrz ppkt 1.7.2). Wcześniejsza znajomość toksyczności substancji badanej (np. z badania ostrej toksyczności i/lub ustalonego w badaniach zakresu) pomaga w doborze właściwych stężeń badanych. Najwyższe stężenie badane nie może przekraczać granicy rozpuszczalności substancji w wodzie.

W przypadku gdy środek ułatwiający rozpuszczenie towarzyszy w przygotowaniu roztworu wyjściowego, jego końcowe stężenie nie może być większe niż 0,1 ml/l i zalecane jest takie same we wszystkich zbiornikach do badań (patrz ppkt 1.6.3). Jednakże należy dołożyć wszelkich starań, aby uniknąć użycia takich materiałów.

1.8.4. Doświadczenia kontrolne

Liczba doświadczeń kontrolnych wody rozcieńczającej zależy od projektu badania (patrz ppkt 1.7-1.7.2). Jeśli stosowany jest środek ułatwiający rozpuszczanie, powinna być przeprowadzona taka sama liczba doświadczeń kontrolnych co liczba doświadczeń kontrolnych z wodą rozcieńczającą.

1.8.5. Częstotliwość oznaczeń analitycznych i pomiarów

W czasie trwania badania stężenia substancji badanej są oznaczane w regularnych odstępach czasu (patrz poniżej).

W badaniach przepływowych wskaźniki przepływu rozcieńczalnika i roztworu wyjściowego toksykanta muszą być sprawdzane w odstępach czasu, najlepiej codziennie, i nie mogą się zmieniać więcej niż 10% w trakcie badania. W przyadku gdy oczekuje się, że stężenie badanej substancji będzie w zakresie ± 20% wartości nominalnej (tj. w zakresie 80-120%; patrz ppkt 1.6.2 i 1.6.3), jest zalecane, aby jako minimum wykonać analizę najmniejszego i największego stężenia substancji badanej na początku badania i w tygodniowych odstępach czasu w okresie późniejszym. W przyadku gdy oczekuje się, że stężenie substancji badanej pozostanie w zakresie ± 20% nominalnej wartości (na podstawie danych stabilności substancji badanej), niezbędne jest analizowanie wszystkich stężeń badanych, ale przy zastosowaniu tego samego systemu.

W półstatycznych (odnawialnych) badaniach, w przypadku gdy oczekuje się, że stężenie badanej substancji pozostanie w zakresie ± 20% nominalnej wartości, jest zalecane, aby jako minimum analizować najniższe i najwyższe stężenia badane świeżo po przygotowaniu i zaraz przed odnowieniem, na początku badań i cotygodniowo w okresie późniejszym. Dla badań, gdzie nie oczekuje się, że stężenie substancji badanej pozostanie w zakresie ± 20% nominału, wszystkie badane stężenia muszą być analizowane, przy zastosowaniu tego samego systemu co dla substancji bardziej stabilnych.

Zalecane jest, aby wyniki oparte były na pomierzonych stężeniach. Jeżeli jednakże dostępne dowody wykazują, że stężenie badanej substancji w roztworze można z powodzeniem utrzymywać w obszarze ± 20% nominalnego lub wstępnie zmierzonego stężenia poprzez okres badania, wtedy wyniki mogą być oparte na wartościach nominalnych lub zmierzonych.

Próbki mogą wymagać przefiltrowania (np. stosując 0,45 μm wymiar poru) lub odwirowania. Odwirowanie jest zalecaną procedurą. Jednakże jeśli badany materiał nie adsorbuje się na filtrze, dopuszczalna jest też filtracja.

W czasie trwania badania powinny być mierzone tlen rozpuszczony, pH i temperatura we wszystkich zbiornikach. Całkowita twardość, alkaliczność i zasolenie (jeśli dotyczy) muszą być mierzone w doświadczeń kontrolnych i w zbiorniku o najwyższym stężeniu. Jako minimum należy pomierzyć rozpuszczony tlen i zasolenie (jeśli dotyczy) trzy razy (na początku, w środku i pod koniec badania). W badaniach półstatycznych jest zalecane, aby rozpuszczony tlen był mierzony częściej, najlepiej przed i po każdej wymianie wody lub co najmniej raz na tydzień. Wartość pH na początku i na końcu każdej wymiany wody w badaniach statycznych odnawialnych i co najmniej cotygodniowo w badaniach przepływowych. Twardość i alkaliczność powinny być mierzone jednorazowo w każdym badaniu. Zalecane jest stałe monitorowanie temperatury w przynajmniej jednym zbiorniku do badań.

1.8.6. Obserwacje

Ważenie: pod koniec badania wszystkie ryby, które przeżyły, muszą być zważone jako masa wilgotna (osuszone) albo grupowo z badanego zbiornika albo pojedynczo. Zalecane jest ważenie ryb z badanego zbiornika, zamiast poszczególnych ryb, gdyż wymaga to indywidualnego oznaczenia ryby. W przypadku pomiarów wagi poszczególnych ryb w celu oznaczenia wskaźnika szczególnego rozwoju określonej ryby, wybrana technika oznaczania powinna zapobiegać stresowaniu zwierząt (alternatywne do oznaczania w stanie zamrożonym jest stosowne oznaczenie ryby np. kolorową cienką linią).

Ryby powinny być sprawdzane codziennie w czasie trwania okresu badania na jakiekolwiek zewnętrzne odstępstwa od normalności (takie jak krwotoki, odbarwienia) oraz nienormalne zachowanie. Każdy przypadek śmiertelny musi być odnotowany, a martwa ryba usunięta tak szybko jak to możliwe. Martwe ryby nie są zastępowane, wskaźnik obciążenia i gęstość wyjściowa są wystarczające, aby zapobiec wpływowi na rozwój poprzez zmiany w ilości ryb na zbiornik. Jednakże zachodzi potrzeba dostosowania wskaźnika żywieniowego.

2. DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ

2.1. OPRACOWANIE WYNIKÓW

Jest zalecane, aby statystyka obejmowała zarówno projekt jak i analizę badania, ponieważ niniejsza metoda badania pozwala na uwzględnienie znacznej zmiany w projekcie doświadczenia, taką jak na przykład ilość komór do badań, liczbę stężeń badanych, liczbę ryb itd. Uwzględniając dostępne opcje w projekcie badania nie podano tutaj informacji dotyczących procedur statystycznych.

Wskaźniki rozwoju nie powinny być obliczane w odniesieniu do zbiorników do badań, gdy śmiertelność przekracza 10%. Jednakże wskaźnik śmiertelności powinien być wskazany w odniesieniu do wszystkich stężeń badanych.

Którakolwiek metoda jest stosowana do analizy danych, głównym pojęciem jest wskaźnik szczególnego rozwoju r między czasem t₁ i czasem t₂. Może to być określone na kilka sposobów zależnych od tego, czy ryby były indywidualnie oznaczane czy nie albo czy wymagana jest średnia zbiornika.

grafika

2.1.1. Regresyjna analiza wyników (modelowanie stężenie-reakcja)

Niniejsza metoda analizy dostosowuje odpowiednią matematyczną zależność między wskaźnikiem szczególnego rozwoju a stężeniem i stąd umożliwia obliczenie "EC_x", tj. każdej wymaganej wartości WE. Stosując niniejszą metodę obliczenia r dla określonej ryby (r₁), nie jest konieczne i zamiast tego analiza może być oparta na średniej zbiornikowej wartości r (r₂). Ta ostatnia metoda jest zalecana. Jest także bardziej właściwa w przypadku użycia najmniejszych gatunków.

Średnie zbiornikowe wskaźniki szczególnego rozwoju (r₂) muszą być wykreślone graficznie w zależności od stężenia w celu sprawdzenia zależności reakcji stężenia.

Dla wyrażenia zależności między r₂ a stężeniem powinien być wybrany właściwy model, a wybór musi być poparty odpowiednim uzasadnieniem.

Jeśli ilości ryb, które przeżyły w każdym zbiorniku, są nierówne, wtedy proces dostosowania modelu albo prostego, albo nieliniowego powinien być rozważony, aby uwzględnić nierówność rozmiarów grup.

Metoda dostosowania modelu musi umożliwiać oszacowanie, czy na przykład EC₂₀ i jego rozrzut (czy błąd standardowy, czy przedział ufności) może być wyprowadzony. Wykres dopasowanego modelu powinien być przedstawiony w zależności od danych tak, aby odpowiedniość dopasowania modelu była widoczna (9) (19) (20) (21).

2.1.2. Analiza wyników dla oszacowania LOEC

Jeżeli badanie obejmuje skopiowane zbiorniki przy wszystkich poziomach stężeń, oszacowanie LOEC może być oparte na analizie wariancji (ANOVA) średniego zbiornikowego wskaźnika szczególnego rozwoju (patrz ppkt 2.1), według odpowiednich metod (np. badania Dunnetta lub Williamsa (13) (14) (15) (22)) porównywania średniego r w odniesieniu do każdego stężenia ze średnią r w odniesieniu do doświadczeń kontrolnych dla określenia najniższego stężenia, dla którego ta różnica jest znacząca przy poziomie prawdopodobieństwa 0,05. Jeśli wymagane przyjęcie dla metod parametrycznych nie odpowiada nienormalnemu rozkładowi (np. badanie Shapiro-Wilka) lub heterogenicznej wariancji (badanie Bartletta), należy podjąć rozważania w celu przekształcenia danych do jednolitych wariancji przed zastosowaniem ANOVA albo przeprowadzeniem ważonego ANOVA.

Jeśli badanie nie obejmuje duplikatów zbiorników dla każdego stężenia, ANOVA na podstawie zbiorników będzie niesensytywna albo niemożliwa. W tej sytuacji dopuszczalnym kompromisem jest ANOVA na pseudoszczególnym wskaźniku rozwoju r₃ dla poszczególnych ryb.

Średnia r₃ dla każdego stężenia badanego może wtedy być porównywana ze średnią r₃ dla doświadczeń kontrolnych. LOEC może być wtedy określona jak poprzednio. Trzeba jednak uznać, że niniejsza metoda nie umożliwia wprowadzania poprawek ani nie zabezpiecza przed zmiennościami między zbiornikami, poza tymi które są liczone dla zmienności między poszczególnymi rybami. Jednakże doświadczenie pokazało (9), że zmienność między zbiornikami jest bardzo mała w porównaniu ze zmiennością wewnątrz zbiorników (tj. między rybami). Jeśli poszczególne ryby nie są włączone do analizy, poboczna metoda identyfikacji i uzasadnienie jej użycia życia muszą być przedstawione.

2.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW

Wyniki muszą być interpretowane z ostrożnością, w przypadku gdy mierzone stężenie toksykanta w roztworach badanych wypada na poziomie granicy wykrywalności metody analitycznej lub w badaniach półstatycznych, gdy stężenie substancji badanej obniża się między świeżo przygotowanymi roztworami i przed wymianą.

2.3. SPRAWOZDANIE Z BADANIA

Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:

2.3.1. Substancja użyta w badaniu:

- natura fizyczna i odpowiednie właściwości fizykochemiczne,

- dane identyfikacji chemicznej, włączając czystość i metodę analityczną kwantyfikacji substancji badanej, tam gdzie jest to stosowne.

2.3.2. Gatunki użyte w badaniu

- możliwie nazwa naukowa,

- szczep, wymiar, dostawca, wszystkie przedtraktowania, itp.

2.3.3. Warunki badania:

- zastosowana procedura badania (np. półstatyczna/odnawialna, przepływowa, obciążenie, gęstość wyjściowa itp.),

- projekt badania (np. liczba zbiorników do badań, stężenia badane i duplikatów, liczba ryb na zbiornik),

- metoda przygotowania roztworów wyjściowych i częstotliwość odnawiania (środek ułatwiający rozpuszczanie i jego stężenie musi być podane, jeśli jest stosowany),

- nominalne stężenia użyte w badaniu, średnie wielkości mierzonych i ich standardowe odchylenia w zbiornikach do badań metody, którymi je uzyskano, oraz dowody, że pomiary odnoszą się do stężeń substancji badanej w prawdziwym roztworze,

- charakterystyka wody rozcieńczającej: pH, twardość, alkaliczność, temperatura, stężenie rozpuszczonego tlenu, poziom pozostałości chloru (jeśli jest zmierzony), całkowity węgiel organiczny, zawieszone cząstki stałe, zasolenie ośrodka badanego (jeśli jest zmierzony) oraz każde inne wykonane pomiary,

- jakość wody w obrębie zbiorników do badań: pH, twardość, temperatura i stężenie rozpuszczonego tlenu,

- szczegółowe informacje dotyczące karmienia (np. rodzaj pożywienia, źródło, ilość podawana i częstotliwość).

2.3.4. Wyniki:

- dowody, że doświadczenia kontrolne odpowiadają kryteriom ważności dla przeżycia oraz dane śmiertelności zdarzającej się w każdym stężeniu badanym,

- zastosowane techniki statystyczno-analityczne, statystyka oparta na duplikatach lub rybach, opracowanie danych i uzasadnienie użytych technik,

- stabelaryzowane dane wagi średniej i indywidualnej ryb w dniach 0, 14 (jeśli są zmierzone) i 28 wartości średniej zbiornikowej lub pseudoszczególnych wskaźników rozwoju (jeśli to stosowne) w okresie 0-28 dni lub możliwie 0-14 i 14-28,

- wyniki analizy statystycznej (tj. analizy regresyjnej lub ANOVA) zalecane w tabelarycznej i graficznej formie oraz LOEC (p = 0,05) i NOEC lub EC_x z, o ile możliwe, błędami standardowymi, jeśli właściwe,

- wypadki wszystkich niezwykłych reakcji ryb i wszystkie wizualne efekty, wytworzone przez substancję badaną.

3. BIBLIOGRAFIA

(1) Solbe J. F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals (CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for Studying the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. WRc Report No PRD 1388-M/2.

(2) Meyer, A., Bierman, C. H. and Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology: an invitation to the comparative method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, pp. 231-236.

(3) Ashley S., Mallett M. J. and Grandy N. J. (1990). EEC Ring Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M.

(4) Crossland N. O. (1985). A method to evaluate effects of toxic chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, pp. 1855-1870.

(5) Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P. D., Market M., Munk R., Scholz N. and Höfte B. B. (1991). Effect of 3,4-dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish (Brachydanio rerio): results of a comparative laboratory study. Ecotox. Environ. Safety, 21, pp. 157-164.

(6) Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biological field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japan.

(7) Holcombe, G. W., Benoit D. A., Hammermeister, D. E., Leonard, E. N. and Johnson, R. D. (1995). Acute and long-term effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryzias latipes). Arch. Environ. Conta. Toxicol. 28, pp. 287-297.

(8) Benoit, D. A., Holcombe, G. W. and Spehar, R. L. (1991). Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese medaka (Oryzias latipes). Ecological Research Series EPA-600/3-91-063. US Environmental Protection Agency, Duluth, Minnesota.

(9) Stephan C. E. and Rogers J. W. (1985). Advantages of using regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Symposium, ASTM STP 891, R. C. Bahner and D. J. Hansen, eds., American Society for Testing and Materials, Philadelphia, pp. 328-338.

(10) Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, Ontario, Report EPS 1/RM/28, 81 pp.

(11) Cox D. R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt.

(12) Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10-12 December 1991.

(13) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. Assoc., 50, pp. 1096-1121.

(14) Dunnett C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, pp. 482-491.

(15) Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, pp. 103-117.

(16) Johnston, W. L., Atkinson, J. L., Glanville N. T. (1994). A technique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout, Oncorhynchus mykiss: effect of feeding level. Aquaculture 120, pp. 123-133.

(17) Quinton, J. C. and Blake, R. W. (1990). The effect of feed cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Journal of Fish Biology, 37, pp. 33-41.

(18) Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 pp.

(19) Bruce, R. D. and Versteeg D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11, pp. 1485-1494.

(20) DeGraeve, G. M., Cooney, J. M., Pollock, T. L., Reichenbach, J. H., Dean, Marcus, M. D. and McIntyre, D. O. (1989). Precision of EPA seven-day fathead minnow larval survival and growth test; intra and interlaboratory study. Report EA-6189 (American Petroleum Institute Publication, No 4468). Electric Power Research Institute, Palo Alto, CA.

(21) Norbert-King T. J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minnesota. Tech. Rep. No 05-88 of National Effluent Toxicity Assesment Center. Sept. 1988. 12 pp.

(22) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, pp. 510-531.

DODATEK 1

GATUNKI RYB ZALECANE DO BADANIA I ODPOWIEDNIE WARUNKI BADANIA

Gatunki	Zalecana temperatura badania zakres temperatur (°C)	Okres naświetlania (godziny)	Zalecany zakres początkowej wagi ryby (g)	Wymagana dokładność pomiarowa	Wskaźnik obciążenia (g/l)	Gęstość wyjściowa (na litr)	Pokarm	Czas trwania badania (dni)
Zalecane gatunki:
Oncorhynchus mykiss Pstrąg tęczowy	12,5-16,0	12-16	1-5	100 mg	1,2-2,0	4	sucha pasza dla narybka	≥ 28
Inne dobrze udokumentowane gatunki:
Danio rerio	21-25	12-16	0,050-0,100	1 mg	0,2-1,0	5-10	żywa żywność	≥ 28
Zebrafish							(Brachionus Artemia)
Oryzias latipes	21-25	12-16	0,050-0,100	1 mg	0,2-1,0	5-20	Żywa żywność	≥ 28
Ricefish (Medaka)							(Brachionus Artemia)

DODATEK 2

NIEKTÓRE CECHY CHEMICZNE DOPUSZCZONEJ WODY ROZCIEŃCZAJĄCEJ

Substancja	Stężenie
Cząstki stałe	< 20 mg/1
Całkowity węgiel organiczny	< 2 mg/1
Niezjonizowany amoniak	< 1 μg/l
Pozostałość chloru	< 10 μg/1
Całkowite pestycydy fosforoorganiczne	< 50 ng/1
Całkowite pestycydy chloroorganiczne plus polichlorowane bifenyle	< 50 ng/1
Całkowity chlor organiczny	< 25 ng/1

DODATEK 3

LOGARYTMICZNE SERIE STĘŻEŃ ODPOWIEDNICH DLA BADANIA TOKSYCZNOŚCI (9)

Kolumna (liczba stężeń między 100 i 10, lub między 10 i 1) ⁽¹⁾
1	2	3	4	5	6	7
100	100	100	100	100	100	100
32	46	56	65	68	72	75
10	22	32	40	46	52	56
3,2	10	18	25	32	37	42
1,0	4,6	10	16	22	27	32
	2,2	5,6	10	15	19	24
	1,0	3,2	6,3	10	14	18
		1,8	4,0	6,8	10	13
		1,0	2,5	4,6	7,2	10
			1,6	3,2	5,2	7,5
			1,0	2,2	3,7	5,6
				1,5	2,7	4,2
				1,0	1,9	3,2
					1,4	2,4
					1,0	1,8
						1,3
						1,0
⁽¹⁾ Serie pięciu (lub więcej) kolejnych stężeń mogą być wybrane z kolumny. Punkt środkowy między stężeniami w kolumnie (x) są znajdowane w kolumnie (2x + 1). Zamieszczone wartości przedstawiają stężenia wyrażone w procentach objętościowo lub wagowo (mg/l lub μg/l). Wartości mogą być zwielokrotniane lub dzielone przez każdą potęgę 10, jeśli to konieczne. Kolumna 1 może być używana, jeśli była znaczna niepewność w poziomie toksyczności.

C.15. RYBY, KRÓTKOTERMINOWE BADANIE TOKSYCZNOŚCI NA EMBRIONIE I NARYBKU

1. METODA

Niniejsze badanie toksyczności krótkoterminowej jest kopią OECD TG 212 (1998).

1.1. WPROWADZENIE

Niniejsze krótkoterminowe badanie toksyczności na rybim embrionie i narybku jest krótkoterminowym badaniem, w którym etapy życia od świeżo zapłodnionego jaja do końca stadium narybka są poddane ekspozycji. W badaniu tym niewymagane jest karmienie, pod warunkiem że próba zostanie ukończona do momentu, w którym narybek jest jeszcze żywiony z worka żółtka.

Celem badania jest określenie śmiertelnego i w ograniczonym zakresie podśmiertelnego działania substancji chemicznych na szczególne stadia oraz gatunki badane. Niniejsze badanie dostarcza użytecznych informacji tak, że a) stanowi połączenie między badaniami śmiertelnymi i podśmiertelnymi; b) jest wykorzystywane jako badanie obrazujące dla badania na pełnym wczesnym stadium życia albo dla badań przewlekłej toksyczności i c) jest wykorzystywane dla badania gatunków, w przypadku gdy techniki gospodarki rolnej nie są wystarczająco zaawansowane do objęcia okresu zmian od stanu endogennego do egzogennego żywienia się.

Należy uwzględnić, że tylko badania obejmujące wszystkie stadia cyklu życia ryby są ogólnie zdolne do dokładnego oszacowania przewlekłej toksyczności substancji chemicznych na ryby oraz że jakiekolwiek zmniejszenie narażenia odnoszące się do etapów życia zmniejsza sensytywność i tak oszacowaną za nisko przewlekłą toksyczność. Dlatego oczekuje się, że badanie na embrionie i narybek będą mniej sensytywne niż badanie na pełnym wczesnym stadium życia, szczególnie w odniesieniu do substancji chemicznych o wysokiej lipofilności (log P_ow > 4) oraz substancji chemicznych o szczególnym sposobie toksycznego działania. Jednakże mniejsze różnice w sensytywności między dwoma badaniami są oczekiwane w odniesieniu do substancji chemicznych o nieszczególnym, narkotycznym sposobie działania (1).

Przed publikacją niniejszego badania większość doświadczeń z tym badaniem embrionu i narybka było ze słodkowodną rybą Danio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae - zwyczajowa nazwa zebrafish). Bardziej szczegółowe informacje dotyczące przeprowadzania badań dla tego gatunku podano w dodatku 1. Nie wyklucza to użycia innych gatunków, w odniesieniu do których doświadczenie jest również dostępne (tabela IA i IB).

1.2. DEFINICJE

Najniższy obserwowany skutek stężenia (LOEC): jest to najmniejsze badane stężenie substancji badanej, przy której obserwuje się znaczący skutek (przy p < 0,05) w porównaniu z doświadczeniem kontrolnym. Jednakże wszystkie badane stężenia powyżej LOEC muszą wykazywać szkodliwy skutek, równy lub większy niż ten obserwowany przy LOEC.

Nieobserwowany skutek stężenia (NOEC): jest stężeniem badanym bezpośrednio poniżej LOEC.

1.3. ZASADA BADANIA

Stadia embrionalne i narybka są eksponowane na zakres stężeń badanej substancji rozpuszczonej w wodzie. W granicach protokołu jest możliwy wybór między procedurami półstatyczną i przepływową. Wybór zależy od natury badanej substancji. Badanie rozpoczyna się od umieszczenia zapłodnionych jaj w komorze do badań i jest kończony zaraz przed tym, gdy worek żółtka jakiejkolwiek larwy w jakiejkolwiek z komór do badań został całkowicie zaabsorbowany lub przed śmiercią głodową rozpoczynającą się w doświadczeniach kontrolnych. Skutki śmiertelne i podśmiertne są oceniane i porównywane z wartościami kontrolnymi w celu ustalenia najniższego obserwowanego skutku stężenia, a stąd nieobserwowanego skutku stężenia. Ewentualnie mogą być one analizowane, stosując model regresyjny w celu oszacowania stężenia powodującego dany skutek procentowy (tj. LC/EC_x, gdzie x jest określony jako skutek %).

1.4. INFORMACJE DOTYCZĄCE SUBSTANCJI UŻYTEJ W BADANIU

Wyniki badania ostrej toksyczności (patrz metoda C.1) najlepiej przeprowadzonego z gatunkami wybranymi do niniejszego badania powinny być dostępne. Wyniki mogą być użyteczne w doborze odpowiedniego zakresu badanych stężeń w badaniu we wczesnym stadium życia. Rozpuszczalność w wodzie (łącznie z rozpuszczalnością w wodzie badanej) i ciśnienie pary badanej substancji powinny być znane. Powinna być dostępna wiarygodna metoda analityczna do oznaczania ilościowego substancji w roztworach badanych ze znaną i udokumentowaną dokładnością oraz granicą wykrywalności.

Informacje dotyczące substancji badanej, które są przydatne w ustaleniu warunków badania, obejmują wzór strukturalny, czystość substancji, stabilność w wodzie i na świetle, pK_a, P_ow i wyniki badania całkowitej biodegradacji (patrz metoda C.4).

1.5. WAŻNOŚĆ BADANIA

Aby badanie było ważne, mają zastosowanie następujące warunki:

- całkowite przeżycie zapłodnionych jaj w doświadczeniach kontrolnych, a tam gdzie to jest odpowiednie, w zbiornikach tylko rozpuszczalnikowych musi być większe lub równe granicom określonym w dodatkach 2 oraz 3,

- stężenie tlenu rozpuszczonego musi wynosić między 60% a 100% wartości nasycenia powietrzem (ASV) w trakcie badania,

- temperatura wody nie może się różnić więcej niż ± 1,5° C między komorami do badań lub między kolejnymi dniami w dowolnym momencie podczas trwania badania i powinno być w granicach zakresu temperatur, określonego w odniesieniu do badanych gatunków (dodatki 2 i 3).

1.6. OPIS METODY BADANIA

1.6.1. Komory do badań

Można użyć jakichkolwiek szklanych i innych obojętnych chemicznie zbiorników. Wymiary zbiorników muszą być dostatecznie duże, aby zapewnić zgodność ze wskaźnikiem obciążenia (patrz ppkt 1.7.1.2). Jest zalecane, aby komory do badań były losowo rozmieszczone w obszarze badania. Losowo zaprojektowany blok z traktowaniem w każdym bloku jest zalecane do całkowicie losowo wybranego projektu, gdy występują systematyczne skutki w laboratorium, które mogą być skontrolowane poprzez wykorzystanie blokowania. Blokowanie, jeśli jest wykorzystane, powinno być uwzględnione w późniejszej analizie danych. Komory do badań powinny być ekranowane od niepożądanych zakłóceń.

1.6.2. Wybór gatunków ryb

Zalecane gatunki ryb podano w tabeli 1A. To nie wyklucza wykorzystania innych gatunków (przykłady podano w tabeli 1B), ale procedura badania musi być dostosowana w celu zapewnienia odpowiednich warunków badania. W tym przypadku należy podać racjonalne uzasadnienie dla wyboru gatunku i metody doświadczalnej.

1.6.3. Utrzymanie wylęgu ryb

Szczegółowe informacje dotyczące utrzymania wylęgu wyjściowego w zadawalających warunkach można znaleźć w OECD TG 210⁽¹⁾ i w bibliografii (2) (3) (4) (5) (6).

1.6.4. Postępowanie z embrionami i larwami

Embriony i larwy poddawane są wystawianie na badanie w obrębie głównego zbiornika, w mniejszych zbiornikach wyposażonych w siatki po bokach lub na końcach, pozwalające na przepływ roztworu badanego przez zbiornik. Nieburzliwy przepływ przez te małe zbiorniki jest powodowany przez zanurzanie ich za pomocą ramienia poruszającego zbiornik w górę i w dół, ale utrzymującego zawsze organizmy w zanurzeniu; można wykorzystać także system syfonowopłuczący. Zapłodnione jaja łososiowatych ryb są podpierane na półkach lub siatkach ze szczelinami wystarczająco dużymi, by umożliwić larwom spadanie przez nie po wylęgu. Użycie pasteryzowanych pipet jest właściwe do usunięcia embrionów i larw w badaniach półstatycznych z całkowitym odnawianiem codziennym (patrz ppkt 1.6.6).

W przyadku gdy pojemniki na jaja, siatki albo oczka używano do utrzymywania jaj wewnątrz głównego zbiornika do badań, umocowania te powinny być usunięte po wylęgu larw ⁽¹⁾, poza zachowaniem oczek zapobiegających ucieczce ryb. Jeśli zachodzi konieczność przeniesienia larw, nie można ich wystawiać na powietrze i nie wolno używać sieci do wypuszczania ryb z pojemników jaj (taka ostrożność nie jest konieczna dla trochę mniej delikatnych gatunków, np. karpia). Czas takiego przeniesienia zmienia się w zależności od gatunku i przeniesienia nie zawsze są konieczne. Dla techniki półstatycznej można stosować zlewki lub płytkie pojemniki, a jeśli konieczne wyposażone w ekran z oczkami, nieznacznie podniesiony powyżej dna zlewki. Jeśli objętość tych pojemników jest wystarczająca do zapewnienia wymagań obciążenia (patrz 1.7.1.2), nie jest konieczne przenoszenie embrionów lub larw.

1.6.5. Woda

Każda woda, która odpowiada chemicznym cechom akceptowalnej wody rozcieńczającej, jak wymieniono w dodatku 4 i w której badane gatunki wykazują przeżycie w doświadczeniu kontrolnym co najmniej tak dobre jak te opisane w dodatkach 2 i 3, może być stosowana jako woda do badań. Powinna być stałej jakości w okresie trwania badania. Wartość pH wody powinna pozostawać w zakresie ± 0,5 jednostek pH. W celu zapewnienia, aby rozcieńczająca woda nie miała falowego wpływu na wyniki badania (np. przez kompleksowanie substancji badanej) lub negatywnego działania na przeprowadzenie wylęgu wyjściowego, należy okresowo pobierać próbki wody do analizy. Co trzy miesiące, na przykład, powinny być dokonane pomiary metali ciężkich (takich jak Cu, Pb, Zn, Hg, Cd i Ni), głównych anionów i kationów (np. Ca, Mg, Na, K, Cl i SO₄), pestycydów (np. całkowita ilość fosforo- i chloroorganicznych), całkowitych węgli organicznych i zawiesin ciał stałych, w przypadku gdy rozcieńczająca woda jest znana jako stosunkowo stała w jakości. Jeśli można przedstawić dane, że jakość wody była stała przynajmniej przez rok, oznaczenia mogą być mniej częste, a przedziały rozszerza się (np. co sześć miesięcy).

1.6.6. Roztwory stosowane w badaniu

Roztwory w badaniu o wybranym stężeniu są przygotowywane poprzez rozcieńczanie roztworu podstawowego.

Zalecane jest przygotowanie roztworu podstawowego przez proste wymieszanie badanej substancji w wodzie rozcieńczającej w sposób mechaniczny (np. mieszadło lub ultradźwieki). Kolumny nasyceniowe (rozpuszczające) stosuje się do uzyskania odpowiednio stężonego roztworu podstawowego. W najszerszym możliwym zakresie należy unikać stosowania rozpuszczalników lub dyspergatorów; jednakże takie związki mogą być wymagane w kilku przypadkach w celu wykonania odpowiednio stężonego roztworu podstawowego. Przykładami odpowiednich rozpuszczalników są aceton, etanol, metanol, dimetylosulfotlenek, dimetyloformamid i glikol trójetylenowy. Przykładami odpowiednich dyspergatorów są Cremophor RH40, Tween 80, metyloceluloza 0,01% i HCO-40. Należy zachować ostrożność przy użyciu łatwo biodegradowalnych środków (np. aceton) i/lub wysokolotnych związków, gdyż mogą być przyczyną problemów z rozwojem bakterii w przepływach badań. Gdy stosuje się środki rozpuszczające, nie mogą one mieć znaczącego wpływu na przeżycie i widocznych negatywnych działań na wczesne stadium życia, jak odkryto przy doświadczeniu kontrolnym z rozpuszczalnikiem. Jednakże należy dołożyć wszelkich starań, aby zapobiec stosowaniu takich materiałów.

W odniesieniu do techniki półstatycznej, mogą być prowadzone dwie różne procedury odnawiania: albo i) nowe roztwory badane są przygotowywane w czystych zbiornikach, a jaja i larwy, które przeżyły, są delikatnie przenoszone do nowych zbiorników w małej objętości starego roztworu, zapobiegając ekspozycji na działanie powietrza, lub ii) organizmy badane są utrzymywane w zbiornikach, o ile proporcja (co najmniej trzy czwarte) wody badanej jest zmieniona. Częstotliwość odnawiania ośrodka zależy od stabilności substancji badanej, lecz zalecane jest codzienne odnawianie wody. Jeśli z badań stabilności pierwotnej (patrz ppkt 1.4), wynika że stężenie substancji badanej nie jest stabilne (tj. poza zakresem nominalnego 80-120% lub spada poniżej 80% zmierzonego stężenia początkowego) ponad okres odnowienia, należy rozważyć celowość użycia badania przepływowego. W każdym przypadku należy zachować ostrożność, aby zapobiec stresom dla larw w trakcie czynności odnawiania wody.

W odniesieniu do badań przepływowych wymagany jest system ciągłego dozowania i rozcieńczania roztworu podstawowego substancji badanej (np. pompa dozująca, rozcieńczalnik proporcjonalny, system nasycania) do przesyłania serii stężeń do komór do badań. Szybkości przepływów roztworu podstawowego i rozcieńczającej wody powinny być sprawdzane okresowo, najlepiej codziennie w trakcie trwania badania oraz nie powinny zmieniać się więcej niż 10% w trakcie badania. Jako odpowiedni uznano wskaźnik przepływu równoważny co najmniej pięciu objętościom komory w ciągu 24 godzin (2).

1.7. PROCEDURA

Przydatne informacje dotyczące przeprowadzania na rybich embrionach i narybku badań toksyczności są dostępne w literaturze, której kilka przykładów jest włączonych do części bibliograficznej niniejszego tekstu (7) (8) (9).

1.7.1. Warunki ekspozycji

1.7.1.1. Czas trwania

Badanie powinno rozpocząć się w ciągu 30 minut po zapłodnieniu jaj. Embriony są zanurzane w roztworze badanym przed lub, tak szybko jak to możliwe, po rozpoczęciu stadium rozszczepienia tarczek zarodowych, a w każdym przypadku przed rozpoczęciem stadium gastruli. W odniesieniu do jaj uzyskanych od dostawcy handlowego niemożliwe jest rozpoczęcie badania niezwłocznie po zapłodnieniu. Ponieważ na sensytywność badania poważnie wpływa opóźnienie rozpoczęcia badania, badanie powinno być zapoczątkowane w ciągu ośmiu godzin po zapłodnieniu. Ponieważ larwy nie są karmione w czasie trwania okresu ekspozycji, badanie musi być zakończone, zanim woreczek żółtkowy jakiejkolwiek larwy w którejkolwiek z komór zostanie całkowicie zaabsorbowany lub przed początkiem śmierci głodowej w doświadczeniach kontrolnych. Czas trwania zależy od wykorzystanych gatunków. Kilka zalecanych czasów trwania podano w dodatkach 2 i 3.

1.7.1.2. Obciążenie

Liczba zapłodnionych jaj na początku badania musi być wystarczająca, aby spełnić wymagania statystyczne. Powinny być one losowo rozdzielone między zabiegami, po co najmniej 30 zapłodnionych jaj, rozdzielonych równo (lub tak równo jak to możliwe, ponieważ jest trudne uzyskanie równych partii przy użyciu niektórych gatunków) między co najmniej trzy skopiowane komory do badań używane na jedno stężenie. Wskaźnik obciążenia (biomasa na objętość roztworu badanego) powinien być wystarczająco niski, aby stężenie rozpuszczonego tlenu wynosiło co najmniej 60% ASV i mogło być utrzymane bez napowietrzania. W odniesieniu do badań przepływowych wskaźnik obciążenia nie przekraczający 0,5 g/l na 24 godziny i nieprzekraczający 5 g/l roztworu w dowolnym momencie są zalecane (2).

1.7.1.3. Światło i temperatura

Okres naświetlania i temperatura wody badanej musi być właściwa dla badanego gatunku (dodatek 2 i 3). W celu monitorowania temperatury właściwe jest użycie dodatkowego zbiornika do badań.

1.7.2. Stężenia użyte w badaniu

Zwykle wymagane jest pięć stężeń do badań w odstępie o stały wskaźnik nieprzekraczający 3,2. Przy wyborze zakresu stężeń badanych w badaniach toksyczności ostrej należy wziąć pod uwagę krzywą zależności LC₅₀ od okresu ekspozycji. Użycie mniej niż pięciu stężeń, na przykład w badaniach granicznych, i węższego odstępu stężenia w pewnych okolicznościach może być właściwe. Jeżeli użyto mniej niż pięciu stężeń, powinno być dostarczone uzasadnienie. Stężenie substancji wyższe niż 96 godzin LC₅₀ lub 100 mg/l, którekolwiek jest niższe, nie wymaga badania. Najwyższe stężenie badane nie może przekraczać granicy rozpuszczalności substancji w wodzie.

W przypadku gdy środek ułatwiający rozpuszczenie jest wykorzystany w przygotowaniu roztworów badanych (patrz ppkt 1.6.6), jego końcowe stężenie nie może być większe niż 0,1 ml/l i zalecane jest takie samo we wszystkich zbiornikach do badań.

1.7.3. Doświadczenia kontrolne

Jedno doświadczenie kontrolne z wodą rozcieńczającą (powtórzona odpowiednio), a także, jeśli jest to stosowne, jedno doświadczenie kontrolne ze środkiem ułatwiającym rozpuszczanie (powtórzone odpowiednio) powinno być dodatkowo przeprowadzone obok serii badań.

1.7.4. Częstotliwość oznaczeń analitycznych i pomiarów

W czasie trwania badania stężenia substancji badanej są oznaczane w regularnych odstępach czasu.

W półstatycznych (odnawialnych) badaniach, w przypadku gdy oczekuje się, że stężenie substancji utrzyma się w zakresie ± 20% nominalnego (tj. w zakresie 80-120%; patrz ppkt 1.4, i 1.6.6), jest zalecane, aby jako minimum analizować najniższe i najwyższe stężenia badane świeżo po przygotowaniu i zaraz przed odnowieniem, następnie w co najmniej trzech przypadkach oddzielonych równo poprzez badanie (tj. analizy powinny być wykonywane na próbce z tego samego roztworu - świeżo przygotowanym i przy wymianie).

W odniesieniu do badań, w których nie oczekuje się, że stężenie substancji badanej pozostanie w zakresie ± 20% nominalnego (na bazie danych stabilności substancji), niezbędne jest analizowanie wszystkich badanych stężeń świeżo po przygotowaniu i przy wymianie, zgodnie z tymi samymi warunkami (tj. w co najmniej trzech przypadkach oddzielonych równo poprzez badanie). Oznaczanie stężenia substancji badanej przed wymianą wymagane jest tylko na jednej z kopii zbiornika przy każdym stężeniu badanym. Oznaczenia powinny być dokonywane nie częściej niż co siedem dni. Zalecane jest, aby wyniki oparte były na pomierzonych stężeniach. Jeżeli jednakże dostępne dowody są zdolne wykazać, że stężenie badanej substancji w roztworze zostało z powodzeniem utrzymane w zakresie ± 20% nominalnego lub wstępnie zmierzonego stężenia, poprzez okres badania, wtedy wyniki mogą być oparte na początkowych wartościach nominalnych lub zmierzonych.

W odniesieniu do badań przepływowych właściwe jest użycie podobnego do opisanego dla badań półstatycznych sposobu pobierania próbek (lecz pomiar "starych" roztworów nie jest stosowany w tym przypadku). Jednakże gdy czas trwania badania jest dłuższy niż siedem dni, wskazane jest podniesienie ilości pobieranych próbek podczas pierwszego tygodnia (np. trzy zestawy pomiarów) w celu zapewnienia, aby stężenia badane pozostały stałe.

Próbki mogą wymagać odwirowania lub przefiltrowania (np. stosując 0,45 μm wymiar poru). Jednakże ani odwirowanie, ani filtracja, skutkują zawsze rozdzieleniem frakcji niebioprzyswajalnej substancji badanej od tej, która jest bioprzyswajalna, zatem próbki nie mogą być przedmiotem takiego przetwarzania.

W czasie trwania badania tlen rozpuszczony, pH oraz temperatura powinny być mierzone we wszystkich zbiornikach do badań. Całkowita twardość i zasolenie (jeśli dotyczy) powinny być mierzone w doświadczeniach kontrolnych i w zbiorniku o najwyższym stężeniu. Jako minimum należy pomierzyć rozpuszczony tlen i zasolenie (jeśli dotyczy) trzy razy (na początku, w środku i na koniec badania). W badaniach półstatycznych jest zalecane, aby rozpuszczony tlen był mierzony częściej, najlepiej przed i po każdej wymianie wody lub co najmniej raz na tydzień. Wartość pH na początku i na końcu każdej wymiany wody w badaniach statycznych odnawialnych i co najmniej cotygodniowo w badaniach przepływowych. Twardość powinna być zmierzona jednorazowo w każdym badaniu. Temperatura powinna być mierzona codziennie i zalecane jest stałe monitorowanie temperatury w przynajmniej jednym zbiorniku do badań.

1.7.5. Obserwacje

1.7.5.1. Stadium rozwoju embrionalnego

Stadium embrionalne (tj. stadium gastruli) na początku ekspozycji na działanie substancji badanej powinno być sprawdzone tak dokładnie jak to możliwe. Można tego dokonać, stosując reprezentatywną próbkę jaj odpowiednio zabezpieczonych i przezroczystych. Można również uwzględnić literaturę w odniesieniu do opisu i ilustracji stadiów embrionalnych (2) (5) (10) (11).

1.7.5.2. Wylęg i przeżycie

Obserwacje w zakresie wylęgania i przeżycia powinny być dokonywane co najmniej raz dziennie, a liczby powinny być zarejestrowane. Pożądane może być częstsze dokonywanie obserwacji na początku badania (np. co 30 minut w ciągu trzech pierwszych godzin), ponieważ w kilku przypadkach czas przeżycia jest bardziej istotny od jedynie liczby zgonów (np. gdy występują skutki ostrej toksyczności). Martwe embriony i larwy powinny być usunięte natychmiast po zauważeniu, gdyż gwałtownie się rozkładają. Należy zachować najwyższą ostrożność przy usuwaniu martwych osobników, aby nie stłuc lub fizycznie uszkodzić przylegających jaj/larw, które są bardzo delikatne i wrażliwe. Kryteria dotyczące zgonu zmieniają się według stadium życia:

- w odniesieniu do jaj: szczególnie we wczesnym stadium, znacząca strata przezroczystości i zmiany w zabarwieniu spowodowane przez koagulację i/lub strącania białek prowadzące do białego, nieprzezroczystego wyglądu,

- w odniesieniu do embrionów: zanik ruchu organów i/lub uderzeń serca, i/lub nieprzezroczyste odbarwienie dla gatunków, które są zwykle przezroczyste,

- w odniesieniu do larw: nieruchomość i/lub brak ruchu oddechowego, i/lub brak bicia serca, i/lub białe nieprzezroczyste zabarwienie centralnego systemu nerwowego, i/lub brak reakcji na bodźce mechaniczne.

1.7.5.3. Anormalny wygląd

Liczba larw wykazujących anormalności w kształcie ciała i/lub pigmentacji, stadium absorpcji żółtko-torba powinny być rejestrowane w odpowiednich odstępach czasu zależnych od czasu trwania badania i charakteru opisanej nienormalności. Należy zauważyć, że anormalne embriony i larwy zdarzają się w naturalny sposób i w doświadczeniu(-ach) kontrolnym(-ych) może ich być rzędu kilku procent w jakimś gatunku. Anormalne zwierzęta powinny być jedynie usunięte ze zbiorników do badań i zabite.

1.7.5.4. Abnormalne zachowanie

Abnormalności, np. hiperwentylacja, nieskoordynowane pływanie i nietypowy spokój, powinny być zarejestrowane w odpowiednich odstępach czasu zależnych od czasu trwania badania. Skutki te, choć trudne do określenia ilościowego, gdy są obserwowane, pomagają w interpretacji danych dotyczących śmiertelności, tj. dostarczają informacji dotyczących sposobu toksycznego działania substancji.

1.7.5.5. Długość

Na koniec badania zalecany pomiar indywidualnych długości; można zastosować standardową, widełkową lub całkowitą długość. Jeśli jednakże występuje ogonowe gnicie płetwy lub nadżerka należy zastosować długość nominalną. Ogólnie, w dobrze przebiegającej próbie współczynnik rozrzutu długości między kopiami w doświadczeniach kontrolnych powinien wynosić ≤ 20%.

1.7.5.6. Waga

Na koniec badania mierzona może być waga indywidualna; bardziej pożądana jest sucha waga: (24 h w 60 °C) od wilgotnej wagi (suszenie bibułą). Ogólnie, w dobrze przebiegającej próbie współczynnik rozrzutu wagi między kopiami w doświadczeniach kontrolnych powinien wynosić ≤ 20%.

Obserwacje te wynikają z niektórych lub ze wszystkich następujących danych dostępnych dla analizy statystycznej:

- skumulowana śmiertelność,

- liczba zdrowych larw na koniec badania,

- czas rozpoczęcia wylęgu i czas zakończenia wylęgu (tj. 90% wylęgu w każdej kopii),

- ilość larw wylęgających się każdego dnia,

- długość (i waga) zwierząt, które przeżyły na koniec badania,

- ilość larw zdeformowanych lub o anormalnym wyglądzie,

- ilość larw wykazujących anormalne zachowanie.

2. DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ

2.1. OPRACOWANIE WYNIKÓW

Jest zalecane, aby statystyka była włączona w projekt, jak i analizę badania, ponieważ niniejsza metoda badania umożliwia uwzględnienie znacznej zmiany w projekcie doświadczenia, takiej jak na przykład ilość komór do badań, liczba stężeń badanych, liczba zapłodnionych jaj i zmierzone parametry. Uwzględniając dostępne opcje w projekcie badania, nie podano tutaj informacji dotyczących procedur statystycznych.

Jeśli LOEC/NOECs mają być oszacowane, niezbędne jest w odniesieniu do zmienności analizowanych między każdym zestawem kopii zastosowanie analizy wariancji (ANOVA) lub procedury tablicy wielodzielczej. W celu wykonania wielokrotnego porównania między wynikami dla poszczególnych stężeń i tych dla doświadczeń kontrolnych, metoda Dunnetta jest uznana za użyteczną (12) (13). Inne przydatne przykłady są także dostępne (14) (15). Rozmiar skutku wykrywalnego przy użyciu ANOVA lub innych procedur (tj. moc badania) powinien być obliczony i przedstawiony. Należy odnotować, że nie wszystkie obserwacje wymienione w ppkt 1.7.5.6 są odpowiednie do analizy statystycznej przy zastosowaniu ANOVA. Na przykład skumulowana śmiertelność i liczba zdrowych larw na końcu badania są analizowane przy wykorzystaniu metod probitowych.

Jeśli LC/EC_xs mają być oszacowane, odpowiednia(-e) krzywa(-e), takie jak krzywa logistyczna, musi(-szą) być dopasowane do interesujących danych, stosując metodę statystyczną, taką jak najmniejszych kwadratów lub nieliniową najmniejszych kwadratów. Krzywa(-e) powinna(-y) być parametryzowana(-e) tak, aby interesujące LC/EC_x oraz jego błąd standardowy były szacowane bezpośrednio. To znacznie ułatwia obliczenie granic ufności wokół LC/EC_x. Pod warunkiem że nie ma słusznych przyczyn, aby zalecać poziomy ufności dwustronne, o założonej ufności 95%. Zalecane jest, aby procedura dopasowania dostarczała sposobów w zakresie oceniania znaczenia braku dopasowania. Stosuje się graficzne metody dla dopasowania krzywych. Analiza regresyjna jest odpowiednia w odniesieniu do wszystkich obserwacji wymienionych w ppkt 1.7.5.6.

2.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW

Wyniki powinny być interpretowane z ostrożnością, w przypadku gdy mierzone stężenie toksykanta w roztworach badanych oscyluje na poziomie granicy wykrywalności metody analitycznej. Interpretacja wyników w odniesieniu do stężeń powyżej rozpuszczalności substancji w wodzie również powinna być dokonywana z ostrożnością.

2.3. SPRAWOZDANIE Z BADANIA

Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:

2.3.1. Substancja użyta w badaniu:

- charakter fizyczny i odpowiednie właściwości fizykochemiczne,

- dane identyfikacji chemicznej, włączając czystość i metodę analityczną kwantyfikacji substancji badanej tam, gdzie to jest właściwe.

2.3.2. Gatunki użyte w badaniu:

- nazwa naukowa, szczep, liczba rodzicielskich ryb (tj. ile samic użyto do dostarczenia żądanej ilości jaj do badań), źródło i metoda zbierania zapłodnionych jaj i dalsze postępowanie.

2.3.3. Warunki badania:

- zastosowana procedura testowa (np. półstatyczna lub przepływowa, okres czasu od zapłodnienia do rozpoczęcia badania, obciążenie itp.),

- okres(-y) naświetlania,

- projekt badania (np. liczba komór do badań i kopii, liczba embrionów na kopię, stężenia badane i w kopiach, liczba ryb na zbiornik),

- metoda przygotowania roztworów wyjściowych i częstotliwość odnawiania (środek ułatwiający rozpuszczanie i jego stężenie powinny być podane, jeśli jest zastosowany),

- nominalne stężenia badane, średnie wielkości mierzonych i ich standardowe odchylenia w zbiornikach do badań metody, którymi je uzyskano, oraz dowody, że pomiary odnoszą się do stężeń substancji badanej w roztworze,

- cechy wody rozcieńczającej: pH, twardość, temperatura, stężenie rozpuszczonego tlenu, poziom pozostałości chloru (jeśli jest zmierzony), całkowity węgiel organiczny, zawieszone cząstki stałe, zasolenie ośrodka badanego (jeśli jest zmierzone), oraz wszelkie inne wykonane pomiary,

- jakość wody w zbiornikach do badań: pH, twardość, temperatura i stężenie rozpuszczonego tlenu.

2.3.4. Wyniki:

- wyniki ze wszystkich wstępnych badań stabilności badanej substancji,

- dowody, że doświadczenia kontrolne odpowiadają kryteriom ważności w odniesieniu do przeżycia badanych gatunków (dodatki 2 i 3),

- dane dotyczące śmiertelności/przeżycia na stadiach embrionu i larwy oraz całkowita śmiertelność/przeżycie,

- dni do wylęgu i liczba wylęgłych,

- dane dotyczące długości (i wagi),

- zasięg i opis morfologicznych anormalności, jeśli istnieją,

- zasięg i opis efektów zachowania, jeśli istnieją,

- analiza statystyczna i opracowanie danych,

- w odniesieniu do badań analizowanych przy pomocy ANOVA najniższy obserwowany skutek stężenia (LOEC) przy p = 0,05 i nieobserwowany skutek stężenia (NOEC) w odniesieniu do każdej ocenianej reakcji, włączając opisanie procedur statystycznych użytych do wskazania wymiaru skutku wykrywalnego,

- w odniesieniu do badań analizowanych przy użyciu technik regresyjnych, LC/EC_x i przedziałów ufności wraz z wykresem dopasowanego modelu stosowanego dla ich wyliczenia,

- wyjaśnienie dotyczące każdego odchylenia od niniejszej metody badania.

3. BIBLIOGRAFIA

(1) Kristensen P. (1990). Evaluation of the Sensitivity of Short Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European Communities, 60 pp. June 1990.

(2) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials. E 1241-88. 26 pp.

(3) Brauhn J. L. and Schoettger R. A. (1975). Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel Catfish and Bluegills. p. 54, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.

(4) Brungs W. A. and Jones B. R. (1977). Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures. p. 128, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.

(5) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Biol. 10, pp. 121-173.

(6) Legault R. (1958). A Technique for Controlling the Time of Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish, Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, pp. 328-330.

(7) Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J. E., Rosander B. and Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxicity Test with Zebrafish (Brachydanio rerio) Using Chromium and Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology and Chemistry, 6, pp. 61-71.

(8) Birge J. W., Black J. A. and Westerman A. G. (1985). Short-term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Estimating Chronic Values for Single Compounds and Complex Effluents. Environmental Toxicology and Chemistry 4, pp. 807-821.

(9) Van Leeuwen C. J., Espeldoorn A. and Mol F. (1986). Aquatic Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Compounds. III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout (Salmo gairdneri). J. Aquatic Toxicology, 9, pp. 129-145.

(10) Kirchen R. V. and W. R. West (1969). Teleostean Development. Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological Supply Company.

(11) Kirchen R. V. and W. R. West (1976). The Japanese Medaka. Its care and Development. Carolina Biological Supply Company, North Carolina. 36 pp.

(12) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, pp. 1096-1121.

(13) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. Biometrics, 20, pp. 482-491.

(14) Mc Clave J. T., Sullivan J. H. and Pearson J.G. (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia.

(15) Van Leeuwen C. J., Adema D. M. M. and Hermes J. (1990). Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, pp. 321-334.

(16) Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Early Life Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS 1/RM/28, December 1992, 81 pp.

(17) Dave G. and Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury, Nickel, Lead and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish, Brachydanio rerio. Arch. of Environmental Contamination and Toxicology, 21, pp. 126-134.

(18) Meyer A., Bierman C. H. and Orti G. (1993). The phylogenetic position of the Zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology-an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: pp. 231-236.

(19) Ghillebaert F., Chaillou C., Deschamps F. and Roubaud P. (1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and Environmental Safety 32, pp. 19-28.

(20) US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese Medaka, Oryzias latipes. EPA report EPA/600/3-91/064, Dec. 1991, EPA, Duluth.

(21) US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage Toxicity Tests with Japanese Medaka, (Oryzias latipes). EPA report EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth.

(22) De Graeve G. M., Cooney J. D., McIntyre D. O., Poccocic T. L., Reichenbach N. G., Dean J. H. and Marcus M. D. (1991). Validity in the performance of the seven-day Fathead minnow (Pimephales promelas) larval survival and growth test: an intra- and interlaboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, pp. 1189-1203.

(23) Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, Oxford. Vol. 1, Chapter 10: Methods for spawning, culturing and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estuarine and Marine fish.

(24) Balon E. K. (1985). Early life history of fishes: New developmental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., Dordrecht, 280 pp.

(25) Blaxter J. H. S. (1988). Pattern and variety in development, in: W. S. Hoar and D. J. Randall eds., Fish Physiology, Vol. XIA, Academic press, pp. 1-58.

TABELA 1A: Gatunki ryb zalecane do badania

Słodkowodne

Oncorhynchus mykiss

Pstrąg tęczowy (9) (16)

Danio rerio

Danio pręgowany (7) (17) (18)

Cyprinus caprio

Karp zwykły (8) (19)

Oryzias latipes (20) (21)

Pimephales promelas (8) (22)

TABELE 1B: Przykłady innych dobrze udokumentowanych gatunków, które również zostały użyte

Słodkowodne	Słonowodne
Carassius auratus	Menidia peninsulae
Karaś srebrzysty (8)	(23) (24) (25)
Lepomis macrochirus	Clupea harengus
(8)	Śledź (24) (25)
	Gadus morhua
	Dorsz (24) (25)
	Cyprinodon variegatus
	(23) (24) (25)

⁽¹⁾OECD, Paris, 1992. Test Guideline 210, Fish, Early-life Stage Toxicity Test.

DODATEK 1

WSKAZÓWKI DOTYCZĄCE PROWADZENIA BADANIA TOKSYCZNOŚCI NA EMBRIONACH I NARYBKU RYBY DANIO PRĘGOWANY (BRACHYDANIO RERIO)

WPROWADZENIE

Danio pręgowany pochodzi z wybrzeża Coromandel w Indiach, gdzie zamieszkuje szybko płynące strumienie. Jest to zwykła akwaryjna ryba z rodziny karpiowatych a informacje na temat procedur opieki nad nią i hodowaniu można znaleźć w publikacjach informacyjnych o tropikalnych rybach. Jej biologia i badania łowisk zostały przedstawione przez Laale (1).

Ryba rzadko przekracza 45 mm długości. Ciało jest cylindryczne z 7 do 9 ciemnoniebieskimi poziomymi srebrzystymi pasami. Pasy te przebiegają przez ogon i płetwy odbytowe. Grzbiet jest oliwkowozielony. Samce są szczuplejsze od samic. Samice są bardziej srebrzyste i ich odwłok jest rozszerzony, szczególnie przed tarłem.

Dorosłe ryby są w stanie tolerować duże wahania temperatur, pH i twardości. Jednakże w celu uzyskania zdrowej ryby produkującej jaja dobrej jakości, powinny być zapewnione optymalne warunki.

W czasie trwania tarła, samiec ściga i bodzie samicę i jak tylko jaja zostaną wyrzucone, zapładnia je. Jaja, które są przezroczyste i nieklejące, opadają na dno, gdzie są zjadane przez dorosłe ryby. Światło wpływa na tarło. Jeśli poranne światło jest odpowiednie, ryby trą się we wczesnych godzinach poprzedzających świt.

Samice produkują partie kilkuset jaj w odstępach tygodniowych.

WARUNKI RYB RODZICIELSKICH, ROZMNAŻANIE I WCZESNE STADIA ŻYCIA

Należy wybrać odpowiednią liczbę zdrowych ryb i trzymać je w odpowiedniej wodzie (np. dodatek 4) przynajmniej dwa tygodnie przed zamierzonym tarłem. Grupie ryb należy pozwolić rozmnażać się co najmniej raz, przed utworzeniem partii jaj używanych w badaniu. Gęstość zarybienia w czasie trwania tego okresu nie może przekraczać 1 grama ryby na jeden litr. Regularne zmiany wody lub użycie systemów oczyszczania umożliwia zastosowanie wyższej gęstości. Temperatura wody w zbiornikach przetrzymujących powinna być utrzymana na poziomie 25 ± 2° C. Rybom należy dostarczyć różnorodną dietę, która składa się na przykład z handlowej suchej karmy, żywych świeżo wylęgniętych Arthemia, ochotkowatych, Daphnii, białych robaków (Enchytraeids).

Poniżej określono dwie procedury, które w praktyce doprowadziły do dostatecznej partii zdrowych, zapłodnionych jaj dla prowadzenia badania:

i) Osiem samic i szesnaście samców umieszcza się w zbiorniku zawierającym 50 litrów wody rozcieńczającej, osłania od bezpośredniego światła i pozostawia tak długo jak to możliwe niezakłócenie przez co najmniej 48 godzin. Tackę na ikrę umieszcza się na dnie akwarium, po południu dnia przed startem badania. Tacka na ikrę składa się z ramy (pleksiglas lub inny odpowiedni materiał), o 5-7 cm wysokości z 2-5 mm grubą siatką dołączoną na górze i 10-30 μm drobną siatką na dnie. Pewna liczba "drzew ikrowych" składających się z nieskręconej nylonowej liny jest dołączona do grubej siatki ramy. Po pozostawieniu ryb przez 12 godzin w ciemności włącza się słabe światło, które zapoczątkowuje tarło. Dwie do czterech godzin po tarle tacka na ikrę jest wyjmowana i jaja są zbierane. Tacka na ikrę zapobiega zjedzeniu jaj przez ryby i w tym samym czasie pozwala na łatwe zbieranie jaj. Grupa ryb powinna co najmniej raz trzeć się przed tarłem, z którego jaja są wykorzystywane do badań.

ii) Pięć do dziesięciu rybich samców i samica są umieszczone oddzielnie na co najmniej dwa tygodnie przed planowanym tarłem. Po 5-10 dniach odwłoki samic będą poszerzone i ich rodne brodawki widoczne. Samce nie posiadają brodawek. Tarło jest przeprowadzane w zbiornikach do tarła wyposażonych w fałszywe dno z siatki (jak wyżej). Zbiornik jest napełniany wodą rozcieńczającą tak, aby głębokość wody powyżej siatki wynosiła 5-10 cm. Jedna samica i dwa samce są umieszczane w zbiorniku na dzień przed planowanym tarłem. Temperatura wody jest stopniowo podnoszona do poziomu wyższego niż temperatura aklimatyzacji. Światło jest wyłączane i zbiornik pozostaje w możliwym zakresie w niezakłóconym stanie. Rano włącza się słabe światło, które zapoczątkowuje tarło. Po 2-4 godzinach ryby są usuwane, a jaja zbierane. Jeśli potrzebne są większe partie jaj, uzyskuje się je od jednej samicy, dostateczna ilość zbiorników do tarła zostaje podłączona równolegle. Poprzez rejestrowanie sukcesu reprodukcyjnego indywidualnych samic przed badaniem (wielkość i jakość partii), samice z najwyższym sukcesem reprodukcyjnym są wybierane do hodowli.

Jaja powinny być przeniesione do zbiorników do badań za pomocą szklanych rurek (o wewnętrznej średnicy nie mniej niż 4 mm) zaopatrzonych w elastyczną cebulkę ssącą. Ilość wody towarzysząca jajom przy ich przenoszeniu powinna być tak niewielka, na ile to możliwe. Jaja są cięższe niż woda i opadają w rurce. Należy zachować ostrożność, aby zapobiec kontaktowi jaj (i larw) z powietrzem. Należy wykonać badania mikroskopowe próbki(-ek) z partii w celu zapewnienia, aby nie posiadały one żadnych nieregularności w pierwszym stadium rozwojowym. Dezynfekcja jaj jest niedopuszczalna.

Wskaźnik śmiertelności jaj jest najwyższy w pierwszych 24 godzinach po zapłodnieniu. Śmiertelność 5-40% obserwowana jest często w trakcie trwania tego okresu. Jaja degenerują się jako wynik niedostatecznego zapłodnienia lub wad rozwojowych. Jakość partii jaj wydaje się zależna od samic, chociaż niektóre samice produkują konsekwentnie jaja dobrej jakości, jakiej inne nigdy nie dają. Także wskaźnik rozwoju i wskaźnik wylęgu zmienia się od jednej partii do drugiej. Zapłodnione z powodzeniem jaja i pęcherzyki żółtkowe larw przeżywają na wysokim poziomie, zwykle powyżej 90%. Przy 25° C jaja wylęgają sie 3-5 dni po zapłodnieniu i woreczek żółtkowy absorbuje się około 13 dni po zapłodnieniu.

Rozwój embrionalny został dobrze określony przez Hisaoka i Battle (2). Dzięki przejrzystości jaj i larw powylęgowych obserwuje się postępujący rozwój ryby oraz występowanie zniekształceń. W około cztery godziny po tarle niezapłodnione jaja są odróżnialne od zapłodnionych (3). Dla sprawdzenia tego jaja i larwy są umieszczane w zbiornikach do badań o małej objętości i są obserwowane pod mikroskopem.

Warunki badania mającego zastosowanie do wczesnych stadiów życia są zamieszczone w dodatku 2. Optymalne wartości pH i twardości wody wynoszą odpowiednio 7,8 i 250 mg CaCO₃/l.

OBLICZENIA I STATYSTYKI

Proponowane jest podejście dwuetapowe. Najpierw dane dotyczące śmiertelności, nienormalny rozwój i czas wylęgu są analizowane statystycznie. Następnie w odniesieniu do tych stężeń, przy których nie ma skutków negatywnych żadnego z tych rejestrowanych parametrów, ocenia się statystycznie długość ciała. Niniejsze podejście jest wskazane, gdyż toksykant może zabijać selektywnie mniejsze ryby, opóźniać czas wylęgu i powodować znaczne zniekształcenia, prowadząc w ten sposób do błędnych pomiarów długości. Ponadto jest to z grubsza ta sama ilość ryb zmierzonych do poddania traktowaniu, zapewniając ważność statystyki badania.

OKREŚLENIA LC₅₀ i EC₅₀

Procent przeżycia jaj i larw jest obliczany i korygowany w odniesieniu do śmiertelności w doświadczeniach kontrolnych zgodnie ze wzorem Abbotta (4):

grafika

gdzie:

P = skorygowany % przeżycia

P' = % przeżycia obserwowanego w stężeniu do badań

C = przeżycie w doświadczeniu kontrolnym

Jeśli to możliwe, LC₅₀ jest oznaczana odpowiednią metodą na końcu badania.

Jeśli włączenie morfologicznych anormalności w EC₅₀ jest pożądane, wskazówki można znaleźć w Stephan (5).

OSZACOWANIE LOEC NOEC

Celem badania na jajach i narybku jest porównanie niezerowego stężenia z doświadczeniem kontrolnym, tj. określenie LOEC. Dlatego wielokrotne procedury porównawcze muszą być zastosowane (6) (7) (8) (9) (10).

BIBLIOGRAFIA

(1) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, pp. 121-173.

(2) Hisaoka K. K. and Battle H. I. (1958). The Normal Development Stages of the Zebrafish Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, 311 pp.

(3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 2, pp. 173-181.

(4) Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, Great Britain, pp. 1-333.

(5) Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J. G. Pearson, R. B. Foster and W. E. Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials, pp. 69-81.

(6) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, pp. 1096-1121.

(7) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Control. Biometrics, 20, pp. 482-491.

(8) Williams D. A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. Biometrics, 27, pp. 103-117.

(9) Williams D. A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a Zero Dose Control. Biometrics 28, pp. 519-531.

(10) Sokal R. R. and Rohlf F. J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of Statistics in Biological Research, W. H. Freeman and Co., San Francisco.

DODATEK 2

WARUNKI BADANIA, CZAS TRWANIA i KRYTERIA PRZEŻYCIA w ODNIESIENIU DO ZALECANYCH GATUNKÓW

Gatunek	Temperatura (ºC)	Stopień zasolenia (0/00)	Czas naświetlania (h)	Czas trwania stadium (dni)		Typowy czas trwania badania	Przeżycie w doświadczeniu kontrolnym (mininum %)
Gatunek	Temperatura (ºC)	Stopień zasolenia (0/00)	Czas naświetlania (h)	Embrion	Narybek	Typowy czas trwania badania	Powodzenie wylęgu	Powylęgowe
SŁODKOWODNE
Brachydanio rerio Danio pręgowany	25 ± 1	-	12-16	3-5	8-10	Tak szybko, jak to możliwe, po zapłodnieniu (wczesne stadium gastruli), do 5 dni po wylęgu (8-10 dni)	80	90
Oncorhynchus mykiss Pstrąg tęczowy	10 ± 1 ⁽¹⁾ 12 ± 1 ⁽²⁾	-	0 ⁽³⁾	30-35	25-30	Tak szybko, jak to możliwe, po zapłodnieniu (wczesne stadium gastruli), do 20 dni po wylęgu (50-55 dni)	66	70
Cyprinus carpio Zwykły karp	21-25	-	12-16	5	>4	Tak szybko, jak to możliwe, po zapłodnieniu (wczesne stadium gastruli), do 4 dni po wylęgu (8-9 dni)	80	75
Oryzias latipes	24 ± 1 (1) 23 ± 1 ⁽²⁾	-	12-16	8-11	4-8	Tak szybko, jak to możliwe, po zapłodnieniu (wczesne stadium gastruli), do 5 dni po wylęgu (1 3-16 dni)	80	80
Pimephales promelas	25 ±2	-	16	4-5	5	Tak szybko, jak to możliwe, po zapłodnieniu (wczesne stadium gastruli), do 4 dni po wylęgu (8-9 dni)	60	70
(1) Dla embrionów. (2) Dla larw. (3) Ciemność dla embrionów i larw do jednego tygodnia po wylęgu, z wyjątkiem gdy są sprawdzane. Następnie przytłumione oświetlenie przez badanie.

DODATEK 3

WARUNKI BADANIA, CZAS TRWANIA I KRYTERIA PRZEŻYCIA W ODNIESIENIU DO INNYCH DOBRZE UDOKUMENTOWANYCH GATUNKÓW

Gatunki	Temperatura (ºC)	Zasolenie (0/00)	Czas naświetlania (h)	Czas trwania stadium (dni)		Typowy czas trwania badania embrionów i narybka	Przeżycie w doświadczeniu kontrolnym (minimum %)
Gatunki	Temperatura (ºC)	Zasolenie (0/00)	Czas naświetlania (h)	Embrion	Badanie narybka	Typowy czas trwania badania embrionów i narybka	Powodzenie wylęgu	Powylegowe
SŁODKOWODNE
Carassius auratus Karaś srebrzysty	24 ± 1	-	-	3-4	>4	Tak szybko, jak to możliwe, po zapłodnieniu (wczesne stadium gastruli), do 4 dni po wylęgu (7 dni)	-	80
Leopomis macrochirus Bassek błękitny	21 ± 1	-	16	3	>4	Tak szybko, jak to możliwe, po zapłodnieniu (wczesne stadium gastruli), do 4 dni po wylęgu (7 dni)	-	75
SŁONOWODNE
Menidia peninsulae	22-25	15-22	12	1,5	10	Tak szybko, jak to możliwe, po zapłodnieniu (wczesne stadium gastruli), do 5 dni po wylęgu (6-7 dni)	80	60
Clupea harengus Śledź pospolity	10 ± 1	8-15	12	20-25	3-5	Tak szybko, jak to możliwe, po zapłodnieniu (wczesne stadium gastruli), do 3 dni po wylęgu (23-27dni)	60	80
Gadus morhua Dorsz	5± 1	5-30	12	14-16	3-5	Tak szybko, jak to możliwe, po zapłodnieniu (wczesne stadium gastruli), do 3 dni po wylęgu (18 dni)	60	80
Cyprinodon variegatus	25 ±1	15-30	12	-	-	Tak szybko, jak to możliwe, po zapłodnieniu (wczesne stadium gastruli), do 4/7 dni po wylęgu (28 dni)	>75	80

DODATEK 4

NIEKTÓRE CECHY CHEMICZNE DOPUSZCZONEJ WODY ROZCIEŃCZONEJ

Substancja	Stężenie
Cząstki stałe	< 20 mg/l
Całkowity węgiel organiczny	< 2 mg/l
Niezjonizowany amoniak	< 1 µg/l
Szczątkowy chlor	< 10 µg/l
Całkowite pestycydy fosforoorganiczne	< 50 ng/l
Całkowite pestycydy chloroorganiczne plus polichlorowane bifenyle	< 50 ng/l
Całkowity chlor organiczny	< 25 ng/l

C.16. PSZCZOŁY MIODNE - BADANIE TOKSYCZNOŚCI OSTREJ DROGĄ POKARMOWĄ

1. METODA

Niniejsza metoda badania toksyczności ostrej jest kopią OECD TG 213 (1998).

1.1. WPROWADZENIE

Niniejszy badanie toksyczności jest laboratoryjną metodą, zaprojektowaną do oceny ostrej toksyczności środków ochrony roślin i innych substancji chemicznych do dorosłych robotnic pszczół miodnych.

Przy oszacowaniu i ocenie cech toksyczności substancji chemicznej oznaczenie ostrej toksyczności drogą pokarmową dla pszczół miodnych jest wymagane, np. gdy jest prawdopodobna ekspozycja pszczół na działanie danej substancji chemicznej. Badanie toksyczności ostrej drogą pokarmową jest przeprowadzane dla ustalenia właściwej toksyczności dla pszczół, pestycydów i innych substancji chemicznych. Wyniki niniejszego badania powinny być wykorzystane do określenia potrzeby dalszej oceny. W szczególności niniejsza metoda może być zastosowana w programach odcinkowych oceny niebezpieczeństwa pestycydów dla pszczół, na podstawie kolejnych postępów badań toksyczności laboratoryjnych do półpolowych i polowych eksperymentów (1). Pestycydy mogą być badane jako substancje aktywne (a.s.) lub jako wytworzone produkty.

Standard toksyczności powinien być zastosowany do sprawdzenia wrażliwości pszczół i precyzji procedury badania.

1.2. DEFINICJE

Ostra toksyczność drogą pokarmową: jest negatywnym skutkiem powstającym w granicach maksymalnego okresu 96 godzin po podaniu doustnym pojedynczej dawki badanej substancji.

Dawka: jest ilością substancji badanej spożytej. Dawka jest wyrażana jako masa (μg) substancji badanej na badane zwierzę (μg/pszczołę). Rzeczywista dawka dla każdej pszczoły nie może być obliczona, ponieważ są karmione wspólnie, ale średnia dawka może być oszacowana (całkowita ilość spożytej substancji badanej/ilość badanych pszczół w jednej klatce).

LD₅₀ (średnia dawka śmiertelna) drogą pokarmową: jest statystycznie wyprowadzoną pojedynczą dawką substancji, która powoduje zgonu 50% zwierząt przy podaniu drogą pokarmową. Wartość LD₅₀ jest wyrażona w (μg) substancji badanej na pszczołę. W odniesieniu do pestycydów substancją badaną może być substancja aktywna (a.s.) albo wytworzony produkt zawierający jedną lub więcej niż jedną substancję aktywną.

Śmiertelność: zwierzę jest rejestrowane jako martwe, gdy jest zupełnie nieruchome.

1.3. ZASADA METODY BADANIA

Dorosłe robotnice pszczół miodnych (Apis mellifera) są eksponowane w zakresie dawek substancji badanej rozproszonej w roztworze sacharozy. Następnie pszczoły są karmione tą samą dietą, wolną od substancji badanej. Śmiertelność jest rejestrowana codziennie podczas co najmniej 48 godzin i porównywana z wartościami kontrolnymi. Jeśli wskaźnik śmiertelności zwiększa się między 24. i 48. godziną, podczas gdy śmiertelność w doświadczeniu kontrolnym pozostaje na akceptowalnym poziomie, tj. ≤ 10%, właściwe jest rozciągnięcie czasu trwania badania do maksimum 96 godzin. Wyniki są analizowane w celu obliczenia LD₅₀ w 24. godzinie i 48. godzinie i, w przypadku, gdy badanie jest przedłużone, w 72. i 96. godzinie.

1.4. WAŻNOŚĆ BADANIA

Aby badanie było ważne, mają zastosowanie następujące warunki:

- średnia śmiertelność dla wszystkich doświadczeń kontrolnych nie może przekraczać 10% na końcu badania,

- LD₅₀ normy toksyczności spełnia określony zakres.

1.5. OPIS METODY BADANIA

1.5.1. Zbieranie pszczół

Młode dojrzałe robotnice pszczół z tej samej rasy muszą być użyte, tj. pszczoły w tym samym wieku, statusie żywieniowym itd. Pszczoły powinny być uzyskane z kolonii właściwie odżywianej, zdrowej, tak dalece jak to możliwe, wolnej od chorób, o właściwej królowej, o znanej historii i fizjologicznym statusie. Mogą być zebrane rano przed użyciem lub wieczorem przed badaniem i przechowane w warunkach badania do następnego dnia. Odpowiednie są pszczoły zebrane z ram, bez potomstwa. Należy uniknąć zbierania pszczół wczesną wiosną lub późną jesienią, gdyż w tym okresie mają zmienioną fizjologię. Jeżeli badania muszą być prowadzone wczesną wiosną lub późną jesienią, pszczoły umieszcza się w inkubatorze i hoduje przez tydzień na "pszczelim chlebie" (pyłek zebrany z grzebienia) i roztworze sacharozy. Pszczoły traktowane substancjami chemicznymi, takimi jak antybiotyki, produkty przeznaczone do zwalczania warrozy, itd., nie powinny być używane do badań toksyczności przez cztery tygodnie od końca ostatniego traktowania.

1.5.2. Pomieszczenie i warunki żywienia

Stosuje się łatwe do czyszczenia i dobrze wentylowane klatki. Należy stosować właściwe materiały, na przykład stal nierdzewną, siatkę drucianą, plastikowe lub jednorazowe drewniane klatki. Zalecane są grupy po dziesięć pszczół na klatkę. Wymiary klatek do badań muszą być właściwe do ilości pszczół, tj. zapewniać wystarczającą przestrzeń.

Pszczoły powinny być trzymane w ciemności, w pokoju doświadczalnym w temperaturze 25±2° C. Wilgotność względna, zwykle około 50-70%, powinna być rejestrowana w czasie badania. Procedury postępowania, włączając traktowanie i obserwacje, prowadzi się w dziennym świetle. Roztwory sacharozy w wodzie o stężeniu końcowym 500 g/l (50% wag./obj.) powinny być stosowane jako pokarm. Po podaniu próbnych dawek pokarm powinien być zapewniany ad libitum. System podawania pokarmu powinien umożliwiać rejestrowanie poboru pokarmu w odniesieniu do każdej klatki (patrz ppkt 1.6.3.1). Może to być szklana rura (około 50 mm długości i 10 mm szerokości z otwartym zwężającym się końcem do około 2 mm średnicy).

1.5.3. Przygotowanie pszczół

Zebrane pszczoły mogą być przypadkowo rozmieszczane w klatkach do badań rozmieszczonych losowo w pokoju doświadczalnym.

Pszczoły mogą być zagłodzone przez 2 h przed rozpoczęciem badania. Zalecane jest, aby pszczoły pozbawiono pokarmu przed traktowaniem, tak aby wszystkie pszczoły miały równe warunki odnośnie do zawartości jelit na początku badania. Konające pszczoły powinny być usunięte i zastąpione zdrowymi przed rozpoczęciem badania.

1.5.4. Przygotowanie dawek

W przypadku gdy substancja badana jest związkiem mieszającym się z wodą, roztwarza się ją bezpośrednio w 50-procentowym roztworze sacharozy. W odniesieniu do produktów technicznych i substancji o niskiej rozpuszczalności w wodzie stosuje się nośniki, takie jak organiczne rozpuszczalniki, emulgatory lub dyspergatory o niskiej toksyczności dla pszczół (np. aceton, dimetyloformamid, dimetylosulotlenek). Stężenie nośnika zależy od rozpuszczalności badanej substancji i powinno być takie same dla wszystkich badanych stężeń. Jednakże 1% stężenie nośnika jest ogólnie właściwe i nie może być przekraczane.

Powinny być przygotowane roztwory kontrolne, tj. w przypadku, gdy stosuje się rozpuszczalnik lub dyspergator do rozpuszczenia substancji badanej należy użyć dwóch oddzielnych roztworów kontrolnych: roztwór w wodzie i roztwór sacharozy z układem rozpuszczalnik/dyspergator o stężeniu stosowanym w roztworach dozujących.

1.6. PROCEDURA

1.6.1. Grupy badane i kontrolne

Liczba dawek i testowanych kopii musi spełniać wymagania statystyczne dla oznaczenia LD₅₀ z 95-procentową granicą ufności. Zwykle pięć dawek w serii geometrycznej ze wskaźnikiem nieprzekraczającym 2,2 i obejmującym zakres dla LD₅₀ są wymagane dla badania. Jednakże wskaźnik rozcieńczenia i liczba stężeń w odniesieniu do dozowania muszą być ustalone w zależności od zbocza krzywej toksyczności (dawka w zależności od śmiertelności) i uwzględnione w ramach wybranej metody statystycznej do analizy wyników. Badanie znalezienia zakresu umożliwia wybór właściwych stężeń do dozowania.

Należy użyć minimum trzech kopii grup badanych, po 10 pszczół każda, dozowanych każdym stężeniem badanym. Minimum trzy kontrolne partie, każda po 10 pszczół, powinny być dodatkowo włączone w przebieg serii badań. Partie kontrolne powinny być także włączone, gdy stosowany jest układ rozpuszczalnik/nośnik (patrz ppkt 1.5.4).

1.6.2. Norma toksyczności

W badane serie należy włączyć wzorce toksyczności. Co najmniej trzy dawki muszą być wybrane do pokrycia wartości oczekiwanej LD₅₀. Co najmniej trzy skopiowane klatki, każda zawierająca 10 pszczół, należy użyć dla każdej badanej dawki. Zalecanym wzorcem toksyczności jest dimetoat, dla którego opisana kontaktowa dawka o LD₅₀-24 h, drogą pokarmową jest w zakresie 0,10-0,35 mikrograma substancji czynnej na pszczołę (2). Jednakże inne wzorce toksyczności byłyby również dopuszczalne w przypadku, gdy można dostarczyć wystarczających danych do sprawdzenia oczekiwanej reakcji na dawkę (np. paration).

1.6.3. Ekspozycja

1.6.3.1. Podawanie dawek

Każdej badanej grupie pszczół należy dostarczyć 100-200 mikrolitrów 50-procentowego roztworu sacharozy w wodzie, zawierającego badaną substancję o właściwym stężeniu. Większa objętość jest wymagana w odniesieniu do produktów o niskiej rozpuszczalności, niskiej toksyczności lub stężeniu w składzie, ponieważ muszą być zastosowane wyższe proporcje w roztworze sacharozy. Ilość traktowanej, spożytej diety przez grupę musi być monitorowana. Zużyty podajnik (zwykle 3-4 godziny) powinien być usunięty z klatki i zastąpiony podajnikiem wypełnionym tylko roztworem sacharozy. Roztwory sacharozy są wtedy dostarczane ad libitum. W odniesieniu do niektórych związków odrzucenie wyższego stężenia dawki badanej objawia się w małej konsumpcji pokarmu lub jej braku. Po maksimum 6 godzinach niespożyta traktowana dieta powinna być zastąpiona samym roztworem sacharozy. Ilość spożytej traktowanej diety musi być oszacowana (np. pomiar objętość/waga pozostałej traktowanej diety.

1.6.3.2. Czas trwania

Zalecany czas trwania badania wynosi 48 h po zastąpieniu roztworu badanego roztworem samej sacharozy. Jeśli śmiertelność nadal wzrasta do więcej niż 10% po pierwszych 24 h, czas trwania badania powinien być przedłużony do maksimum 96 h, zapewniając, że śmiertelność w doświadczeniu kontrolnym nie przewyższa 10%.

1.6.4. Obserwacje

Śmiertelność jest rejestrowana w 4 godziny po rozpoczęciu badania, a w okresie późniejszym w 24. i 48 godzinie (tj. po podaniu dawki). Jeśli wymagany jest przedłużony okres obserwacji, następne oceny powinny być dokonane w 24-godzinnych przedziałach czasowych, do maksimum 96 godzin, pod warunkiem że śmiertelność w doświadczniu kontrolnym nie przekroczy 10%.

Ilości pokarmu spożytego na grupę powinna być oszacowana. Porównanie wskaźników spożycia traktowanej i nietraktowanej diety w danych 6 godzinach dostarcza informacji o strawności diety traktowanej.

Wszystkie anormalne efekty zachowania zaobserwowane w trakcie okresu badania powinny być zarejestrowane.

1.6.5. Badanie graniczne

W pewnych przypadkach (np. gdy oczekuje się, że substancja badana posiada niską toksyczność) należy przeprowadzić badanie graniczne, stosując 100 μg a.s./pszczoła w celu ukazania, że LD₅₀ jest większa niż niniejsza wartość. Ta sama procedura powinna być zastosowana do, włączając trzy skopiowane grupy badane dla dawki badanej, odpowiednich doświadczeń kontrolnych, oceny ilości traktowanej diety spożytej oraz użycia normy toksyczności. Jeśli występuje śmiertelność, powinny być przeprowadzone pełne badania. Jeśli obserwuje się podśmiertelne skutki (patrz ppkt 1.6.4), powinny być one zarejestrowane.

2. DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ

2.1. DANE

Dane powinny być zestawione w formie tabelarycznej, pokazując w odniesieniu do każdej traktowanej grupy, jak również w odniesieniu do grup kontrolnych i grup norm toksyczności, ilość użytych pszczół, śmiertelność w dowolnym momencie obserwacji i liczbę pszczół o negatywnym zachowaniu. Analiza danych śmiertelności właściwymi metodami statystycznymi (np. analiza probitowa, średnia krocząca, prawdopodobieństwo dwumianu) (3) (4). Wykreślone krzywe dawka-reakcja w każdym zalecanym momencie obserwacji i obliczenia zboczy krzywych oraz średnie dawki śmiertelne (LD₅₀) z 95-procentowymi granicami ufności. Poprawki dotyczące śmiertelności w doświadzeniach kontrolnych mogą być dokonane przy użyciu poprawki Abbotta (4) (5). W przyadku gdy traktowana dieta nie jest całkowicie spożyta, powinna być ustalona dawka substancji badanej spożytej przez grupę. LD₅₀ powinna być wyrażona w μg substancji badanej na pszczołę.

2.2. SPRAWOZDANIE Z BADANIA

Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:

2.2.1. Substancja użyta w badaniu:

- charakter fizyczny i stosowne właściwości fizykochemiczne (np. stabilność w wodzie, ciśnienie pary),

- dane dotyczące identyfikacji chemicznej, włączając wzór strukturalny, czystość (tj. w odniesieniu do pestycydów identyfikacja i stężenie aktywnej(-ych) substancji).

2.2.2. Gatunki użyte w badaniu:

- nazwa naukowa, rasa, przybliżony wiek (w tygodniach), metoda zbierania, dane dotyczące zbierania,

- informacje dotyczące kolonii używanych do zbierania pszczół badanych, włączając stan zdrowotny, choroby wieku dorosłego, wszystkie wcześniejsze traktowania itd.

2.2.3. Warunki badania:

- temperatura i wilgotność względna pokoju doświadczalnego,

- warunki pomieszczenia włączając typ, wymiary i materiał klatki,

- metody przygotowania roztworu wyjściowego i roztworów badanych (rozpuszczalnik i jego stężenia muszą być podane, gdy zostały zastosowane),

- metoda przygotowania roztworu wyjściowego i częstotliwość odnawiania (środek ułatwiający rozpuszczanie i jego stężenia muszą być podane, gdy zostały zastosowane),

- projekt badania, np. liczba i stężenia badane użyte, ilość doświadczeń kontrolnych w odniesieniu do każdego stężenia badanego i doświadczenia kontrolnego, liczba kopii klatek i liczba pszczół na klatkę,

- data badania.

2.2.4. Wyniki:

- wyniki badań wstępnego szukania zakresu, jeśli wykonano,

- pierwotne dane: śmiertelność przy każdej dawce badanej w dowolnym momencie obserwacji,

- wykresy krzywych dawka-reakcja na koniec badania,

- wartość LD₅₀ z granicami ufności 95% w zalecanym momencie obserwacji, w odniesieniu do substancji badanej i normy toksyczności,

- zastosowane procedury statystyczne do określenia LD₅₀,

- śmiertelność w doświadczeniach kontrolnych,

- inne skutki biologiczne zaobserwowane lub pomierzone np. anormalne zachowanie pszczół (włączając odrzucenie dawki badanej), wskaźnik spożycia diety w traktowanych i nietraktowanych grupach,

- wszelkie odchylenia od opisanych tutaj procedur badania oraz wszelkie inne istotne informacje.

3. BIBLIOGRAFIA

(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products-Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 151-165. March 1993.

(2) Gough, H. J., McIndoe, E. C., Lewis, G. B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981-1992. Journal of Apicultural Research 22, pp. 119-125.

(3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, pp. 99-113.

(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.

(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, pp. 265-267.

C.17. PSZCZOŁY MIODNE - BADANIE KONTAKTOWEJ TOKSYCZNOŚCI OSTREJ

1. METODA

Niniejsza metoda badania kontaktowej toksyczności ostrej jest kopią OECD TG 214 (1998 r.).

1.1. WPROWADZENIE

Niniejsze badanie toksyczności jest laboratoryjną metodą, zaprojektowaną do oceny kontaktowej ostrej toksyczności środków ochrony roślin i innych substancji chemicznych do dorosłych robotnic pszczół miodnych.

Przy oszacowaniu i ocenie cech toksyczności substancji chemicznej oznaczenie ostrej toksyczności kontaktowej dla pszczół miodnych jest wymagane np., gdy jest prawdopodobna ekspozycja pszczół na działanie danej substancji chemicznej. Badanie kontaktowej toksyczności ostrej jest przeprowadzane dla ustalenia właściwej toksyczności w odniesieniu do pszczół, pestycydów i innych substancji chemicznych. Wyniki niniejszego badania powinny być wykorzystane do określenia potrzeby dalszej oceny. W szczególności niniejsza metoda może być stosowana w programach odcinkowych oceny niebezpieczeństwa pestycydów dla pszczół, na podstawie kolejnych postępów badań toksyczności laboratoryjnych do półpolowych i polowych eksperymentów (1). Pestycydy mogą być badane jako substancje aktywne (a.s.) lub jako wytworzone produkty.

Norma toksyczności powinna być zastosowana do sprawdzenia wrażliwości pszczół i precyzji procedury badania.

1.2. DEFINICJE

Ostra toksyczność drogi pokarmowej: są to negatywne skutki powstające w granicach maksymalnego okresu 96 godzin po miejscowym podaniu pojedynczej dawki substancji.

Dawka: jest ilością substancji badanej zastosowanej. Dawka jest wyrażana jako masa (μg) substancji badanej na badane zwierzę (μg/pszczoła).

LD₅₀ (średnia dawka śmiertelna) kontaktowa: jest statystycznie wyprowadzoną pojedynczą dawką substancji, która powoduje zgon u 50% zwierząt poprzez kontakt. Wartość LD₅₀ jest wyrażona w μg substancji badanej na pszczołę. W odniesieniu do pestycydów substancją badaną może być substancja aktywna (a.s.) albo wytworzony produkt zawierający jedną lub więcej niż jedną substancję aktywną.

Śmiertelność: zwierzę jest rejestrowane jako martwe, gdy jest zupełnie nieruchome.

1.3. ZASADA METODY BADANIA

Dorosłe robotnice pszczół miodnych (Apis mellifera) są eksponowane w zakresie dawek substancji badanej rozproszonej we właściwym nośniku przez bezpośrednie nałożenie na tułów (kropelki). Czas trwania badania wynosi 48 h. Jeśli wskaźnik śmiertelności zwiększa się między 24 h a 48 h, podczas gdy śmiertelność w doświadzeniach kontrolnych pozostaje na akceptowalnym poziomie, tj. ≤ 10%, właściwe jest przedłużenie czasu trwania badania do maksimum 96 h. Śmiertelność jest rejestrowana codziennie i porównywana z wartościami kontrolnymi. Wyniki są analizowane w celu obliczenia LD₅₀ w 24 h i 48 h oraz, w przypadku gdy badanie jest przedłużone, w 72 h i 96 h.

1.4. WAŻNOŚĆ BADANIA

Aby badanie było ważne, mają zastosowanie następujące warunki:

- średnia śmiertelność w odniesieniu do wszystkich doświadczeń kontrolnych nie może przekraczać 10% na końcu badania,

- LD₅₀ normy toksyczności odpowiada określonemu zakresowi.

1.5. OPIS METODY BADANIA

1.5.1. Zbieranie pszczół

Powinny być użyte młode dojrzałe robotnice pszczół z tej samej rasy, tj. pszczoły w tym samym wieku, o tym samym statusie żywieniowym itd. Pszczoły powinny być uzyskane z kolonii właściwie odżywianej, zdrowej, tak dalece jak to możliwe wolnej od chorób, o właściwej królowej, o znanej historii i fizjologicznym statusie. Muszą być zebrane rano przed użyciem lub wieczorem przed badaniem i przechowane w warunkach badania do następnego dnia. Odpowiednie są pszczoły zebrane z ram, bez potomstwa. Należy uniknąć zbierania pszczół wczesną wiosną lub późną jesienią, gdyż podczas tego okresu mają zmienioną fizjologię. Jeżeli badania muszą być prowadzone wczesną wiosną lub późną jesienią, pszczoły umieszcza się w inkubatorze i hoduje przez tydzień na "pszczelim chlebie" (pyłek zebrany z grzebienia) i roztworze sacharozy. Pszczoły traktowane substancjami chemicznymi, takimi jak antybiotyki, produkty przeznaczone do zwalczania warrozy i tak dalej nie mogą być używane do badań toksyczności przez cztery tygodnie od chwili zakończenia ostatniego traktowania.

1.5.2. Pomieszczenie i warunki żywienia

Stosuje się łatwe do czyszczenia i dobrze wentylowane klatki. Należy stosować właściwe materiały, na przykład stal nierdzewną, siatkę drucianą, plastikowe lub jednorazowe drewniane klatki. Zalecane są grupy po dziesięć pszczół na klatkę. Wymiary klatek do badań muszą być odpowiednie do ilości pszczół, tj. zapewniać wystarczającą przestrzeń.

Pszczoły powinny być trzymane w ciemności, w pokoju doświadczalnym w temperaturze 25 ± 2° C. Wilgotność względna, zwykle około 50-70%, powinna być rejestrowana w czasie badania. Procedury postępowania, włączając traktowanie i obserwacje, prowadzi się w dziennym świetle. Roztwory sacharozy w wodzie o stężeniu końcowym 500 g/l (50% wag./obj.) stosowane są jako pokarm podawany ad libitum w czasie trwania badania, z użyciem podajnika pszczół. Może to być szklana rura (około 50 mm długości i 10 mm szerokości z otwartym zwężającym się końcem do około 2 mm średnicy).

1.5.3. Przygotowanie pszczół

Zebrane pszczoły są znieczulane dwutlenkiem węgla lub azotem w celu zastosowania substancji badanej. Ilość środka znieczulającego i czas ekspozycji powinien być zminimalizowany. Konające pszczoły powinny być usunięte i zastąpione zdrowymi pszczołami przed rozpoczęciem badania.

1.5.4. Przygotowanie dawek

Substancja badana ma być zastosowana jako roztwór w nośniku, tj. organicznym rozpuszczalniku lub wodny roztwór ze środkiem zwilżającym. Z organicznych rozpuszczalników zalecany jest aceton, lecz mogą być użyte inne organiczne rozpuszczalniki o niskiej toksyczności dla pszczół (np. dwumetyloformamid, dwumetylosulfotlenek). Dla rozproszonych w wodzie określonych produktów i wysokopolarnych substancji organicznych nierozpuszczalnych w rozpuszczalnikowych organicznych nośnikach roztwory łatwiej podawać, gdy przygotuje się słaby roztwór handlowego środka zwilżającego (np. Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, Tween).

Powinny być przygotowane właściwe roztwory kontrolne, tj. w przypadku gdy użyto rozpuszczalnika albo dyspergator dla rozpuszczenia substancji badanej, powinny być zastosowane dwie kontrolne grupy, jedna traktowana wodą i jedna traktowana układem rozpuszczalnik/dyspergator.

1.6. PROCEDURA

1.6.1. Grupy badane i kontrolne

Liczba dawek i badanych kopii powinna odpowiadać wymaganiom statystycznym dotyczącym określenia LD₅₀ z granicami ufności 95%. Zwykle pięć dawek w serii geometrycznej, ze wskaźnikiem nieprzekraczającym 2,2 i obejmującym zakres dla LD₅₀ są wymagane w odniesieniu do badań. Jednakże liczba dawek musi być ustalona w zależności od zbocza krzywej toksyczności (dawka w zależności od śmiertelności) i z uwzględnieniem wybranej metody statystycznej do analizy wyników. Badanie szukania zakresu umożliwia wybór właściwych stężeń do dozowania.

Należy użyć minimum trzech kopii grup badanych, po 10 pszczół każda, dozowanych każdym stężeniem badanym.

Minimum trzy kontrolne partie, każda po 10 pszczół powinny być dodatkowo włączone w przebieg serii badań. Jeśli rozpuszczalnik organiczny lub środek zwilżający jest stosowany, trzy partie kontrolne, każda po 10 pszczół, dla rozpuszczalnika i środka zwilżającego muszą być włączone.

1.6.2. Norma toksyczności

W badane serie należy włączyć normę toksyczności. Co najmnie trzy dawki powinny być wybrane do pokrycia oczekiwanej wartości LD₅₀. Co najmniej trzy skopiowane klatki, każda zawierająca 10 pszczół, należy użyć przy każdej badanej dawce. Zalecanym wzorcem toksyczności jest dimetoat, dla którego opisana kontaktowa dawka LD₅₀-24 h, drogą pokarmową jest w zakresie 0,10-0,35 mikrograma substancji czynnej na pszczołę (2). Jednakże inne normy toksyczności byłyby również dopuszczalne w przypadku gdy można dostarczyć wystarczających danych do sprawdzenia oczekiwanej reakcji na dawkę (np. paration).

1.6.3. Ekspozycja

1.6.3.1. Podawanie dawek

Znieczulone pszczoły są pojedynczo poddawane zabiegowi miejscowego podania dawki. Pszczoły są losowo poddawane różnym próbnym i kontrolnym dawkom. Objętość 1 μl roztworu zawierającego substancję badaną o odpowiednim stężeniu powinna być podana mikroaplikatorem do grzbietowej strony tułowia każdej pszczoły. Można użyć inne objętości, jeśli jest to uzasadnione. Po podaniu dawki pszczoły są umieszczane w klatkach do badań i żywione roztworami sacharozy.

1.6.3.2. Czas trwania

Zalecany czas trwania badania wynosi 48 h. Jeśli śmiertelność wzrasta o więcej niż 10% między 24 h a 48 h, czas trwania badania powinien być przedłużony do maksimum 96 h pod warunkiem że śmiertelność przy doświadczeniu kontrolnym nie przewyższa 10%.

1.6.4. Obserwacje

Śmiertelność jest rejestrowana w 4. godzinie po dozowaniu, a w okresie późniejszym w 24. i 48. godzinie. Jeśli wymagany jest przedłużony okres obserwacji, dalsze oceny powinny być dokonywane w 24-godzinnych przedziałach czasowych, do maksimum 96 godzin, pod warunkiem że śmiertelność przy doświadczeniu kontrolnym nie przekrocza 10%. Wszystkie anormalne skutki zachowywania się w czasie trwania badania powinny być zarejestrowane.

1.6.5. Badanie graniczne

W niektórych przypadkach (np. gdy oczekuje się, że substancja badana posiada niską toksyczność) można przeprowadzić badanie graniczne, stosując 100 μg a.s./pszczołę w celu ukazania, że LD₅₀ jest większa niż niniejsza wartość. Ta sama procedura powinna być zastosowana, włączając trzy skopiowane grupy badane, w odniesieniu do dawki badanej, odpowiednich dawek kontrolnych oraz użycia normy toksyczności. Jeśli występuje śmiertelność, powinny być przeprowadzone pełne badania. Jeśli obserwuje się podśmiertelne skutki (patrz ppkt 1.6.4), powinny one być zarejestrowane.

2. DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ

2.1. DANE

Dane powinny być zestawione w formie tabelarycznej, pokazując w odniesieniu do każdej traktowanej grupy, jak również w odniesieniu do grup kontrolnych i grup normy toksyczności ilość użytych pszczół, śmiertelność w każdym momencie obserwacji i liczbę pszczół o negatywnym zachowaniu. Analiza danych dotyczących śmiertelności właściwymi metodami statystycznymi (np. analiza probitowa, średnia krocząca, prawdopodobieństwo dwumianu) (3) (4). Wykreślone krzywe dawka-reakcja w każdym zalecanym momencie obserwacji (tj. 24 h, 48 h i, jeśli to stosowne, 72 h i 96 h) i obliczenia zboczy krzywych oraz średnie dawki śmiertelne (LD₅₀) z granicami ufności 95%. Poprawki w odniesieniu do śmiertelności przy doświadczeniu kontrolnym powinny być wykonane przy użyciu poprawki Abbotta (4) (5). LD₅₀ powinna być wyrażona w μg substancji badanej na pszczołę.

2.2. SPRAWOZDANIE Z BADANIA

Sprawozdanie z badania musi zawierać nastepujące informacje:

2.2.1. Substancja użyta w badaniu:

- charakter fizyczny i stosowne właściwości fizykochemiczne (np. stabilność w wodzie, ciśnienie pary),

- dane identyfikacji chemicznej, włączając wzór strukturalny, czystość (tj. w odniesieniu do pestycydów identyfikację i stężenie aktywnej substancji).

2.2.2. Gatunki użyte w badaniu:

- nazwa naukowa, rasa, przybliżony wiek (w tygodniach), metoda zbierania, dane dotyczące zbierania,

- informacje dotyczące kolonii używanych do zbierania pszczół badanych, włączając stan zdrowotny, choroby wieku dorosłego, wszystkie wcześniejsze traktowania itd.

2.2.3. Warunki badania:

- temperatura i wilgotność względna pokoju doświadczalnego,

- warunki pomieszczenia, włączając typ, wymiary i materiał klatki,

- metody podawania substancji badanej, np. użyty nośnik, rozpuszczalnik, objętość zastosowanego roztworu badanego, użyte znieczulenie,

- projekt badania, np. ilość i użyte dawki badane, liczba doświadczeń kontrolnych dla próbnej dawki i pomiaru, liczba kopii klatek i liczba pszczół na klatkę,

- data badania.

2.2.4. Wyniki:

- wyniki badań wstępnego szukania zakresu, jeśli wykonano,

- pierwotne dane: śmiertelność przy każdym stężeniu badanym w każdej chwili obserwacji,

- wykresy krzywych dawka-reakcja na koniec badania,

- wartość LD₅₀ z 95-procentowym limitem zaufania w każdym zalecanym momencie obserwacji, w odniesieniu do substancji badanej i normy toksyczności,

- zastosowane procedury statystyczne do określenia LD₅₀,

- śmiertelność w doświadczeniach kontrolnych,

- inne skutki biologiczne zaobserwowane lub pomierzone i wszystkie anormalne reakcje pszczół,

- wszelkie odchylenia od opisanej tutaj metody badania i wszystkie inne istotne informacje.

3. BIBLIOGRAFIA

(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products-Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 151-165. March 1993.

(3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, pp. 99-113.

(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.

(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, pp. 265-267.

C.18. ADSORPCJA/DESORPCJA PRZY UŻYCIU METODY RÓWNOWAGI OKRESOWEJ

1. METODA

Niniejsza metoda jest kopią OECD TG 106, w odniesieniu do określenia adsorpcji/desorpcji gleby przy użyciu metody równowagi okresowej (2000 r.).

1.1. WPROWADZENIE

Metoda uwzględnia próbę obrączkową i warsztat dotyczący wyboru gleby dla rozwoju badania adsorpcji (1) (2) (3) (4), a także istniejące wytyczne na poziomie krajowym (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11).

Badania adsorpcji/desorpcji są użyteczne dla uzyskania podstawowych informacji dotyczących mobilności substancji chemicznych i ich rozłożeniu w ziemnych, wodnych i powietrznych częściach biosfery (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21). Informacje mogą być wykorzystywane w przewidywaniu lub szacowaniu na przykład zdolności substancji chemicznych do degradacji (22) (23), przekształcania i poboru przez organizmy (24); wymywania przez profil gleby (16) (18) (19) (21) (25) (26) (27) (28); lotności z gleby (21) (29) (30); ucieczki z powierzchni ziemi do wód naturalnych (18) (31) (32). Dane dotyczące adsorpcji są wykorzystywane do celów porównawczych i modelowania (19) (33) (34) (35).

Rozłożenie substancji chemicznej między glebę a fazę wodną jest złożonym procesem zależnym od wielu różnych czynników: charakteru chemicznego substancji (12) (36) (37) (38) (39) (40), cech gleby (4) (12) (13) (14) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) (49), czynników klimatycznych takich jak opady deszczu, temperatury, światła słonecznego i wiatru. W ten sposób liczne zjawiska i mechanizmy włączają się w proces adsorpcji substancji chemicznej przez glebę i nie mogą być określone całościowo przez uproszczony model laboratoryjny, jak w niniejszej metodzie. Jednakże nawet jeśli ta próba nie może objąć środowiskowo możliwych przypadków, to dostarcza cennych informacji odnoszących się do adsorpcji substancji chemicznych w środowisku.

Patrz także ogólne wprowadzenie.

1.2. ZAKRES

Metoda ma na celu oszacowanie zachowywania adsorpcji/desorpcji substancji w glebie. Celem jest uzyskanie wartości sorpcji, która jest użyteczna do przewidywania podziału w różnorodności warunków środowiskowych; do tego celu współczynniki adsorpcji równowagowej są ustalane w odniesieniu do substancji chemicznych w różnych glebach, jako funkcja cech gleby (np. zawartość węgla organicznego, zawartość gliny i tekstura gleby oraz pH). Należy użyć różnych typów gleby w celu objęcia jak najszerzej zdarzenia współdziałań danej substancji z glebami naturalnymi.

W niniejszej metodzie adsorpcja przedstawia proces wiązania sie substancji chemicznej do powierzchni gleby; nie odróżnia między różnymi procesami adsorpcji (fizyczna i chemiczna adsorpcja) i takimi procesami, jak rozkład katalizowany powierzchniowo, masową adsorpcją i chemiczną reakcją. Adsorpcji zdarzającej się na cząstkach koloidów (średnica < 0,2 μm) wytwarzanych przez gleby nie uwzględniono.

Parametrami gleby, przypuszczalnie najistotniejszymi w odniesieniu do gleby, są: zawartość węgla organicznego (3) (4) (12) (13) (14) (41) (43) (44) (45) (46) (47) (48); zawartość gliny i tekstura gleby (3) (4) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) i pH w odniesieniu do zjonizowanych związków (3) (4) (42). Inne parametry gleby, które mają wpływ na absorpcję/desorpcję określonej substancji, to efektywna zdolność wymiany kationu (ECEC), zawartość amorficznego żelaza i tlenków glinu, szczególnie w odniesieniu do gleb wulkanicznych i tropikalnych (4), jak również powierzchnia właściwa (49).

Badanie jest zaprojektowane do oceny adsorpcji substancji chemicznej na różnego typu glebach o zróżnicowanym zakresie zawartości węgla organicznego, zawartości gliny i tekstury gleby oraz pH. Obejmuje to trzy warstwy:

Warstwa 1: Badania wstępne w celu ustalenia:

- proporcji gleba/roztwór,

- czasu równowagi dla adsorpcji i ilości substancji badanej zaadsorbowanej w równowadze,

- adsorpcji substancji badanej na powierzchni zbiornika badanego i stabilność badanej substancji w czasie trwania okresu badania.

Warstwa 2: Badanie klasyfikacji: adsorpcja jest badana na pięciu różnych typach gleby za pomocą kinetyki adsorpcji w pojedyńczym stężeniu oraz określenie współczynnika podziału K_d i K_oc.

Warstwa 3: Określenie izoterm adsorpcji Freundlicha dla ustalenia wpływu stężenia na zasięg adsorpcji na glebach.

Badania desorpcji za pomocą kinetyki desorpcji/Freundlicha desorpcji izotermy (dodatek 1).

1.3. DEFINICJE i JEDNOSTKI

grafika

1.4. ZASADA METODY BADANIA

Znane objętości roztworów badanej substancji, nieetykietowanej czy też etykietowanej izotopami o znanym stężeniu w 0,01 M CaCl₂ są dodane do próbek gleby o znanej suchej masie, wcześniej zrównoważone w 0,01 M CaCl₂. Mieszanina jest mieszana przez właściwy czas. Zawiesiny gleby rozdziela się następnie przez odwirowanie, i jeśli pożądane filtruje, a fazę wodną poddaje analizie. Ilość substancji badanej zaadsorbowana na próbce gleby jest obliczona jako różnica między ilością substancji badanej początkowo obecnej w roztworze a ilością pozostałą na koniec doświadczenia (metoda pośrednia).

Jako opcja ilość badanej substancji zaadsorbowanej jest także bezpośrednio ustalana analizą gleby (metoda bezpośrednia). Niniejsza procedura obejmująca stopniową ekstrakcję gleby właściwym rozpuszczalnikiem jest zalecana, w przypadku gdy różnica w stężeniu roztworu substancji nie może być dokładnie ustalona. Przykładami takich przypadków są: adsorpcja substancji badanej na ściankach zbiornika, niestabilność substancji badanej w skali czasu doświadczenia, słaba adsorpcja dająca tylko małe zmiany stężenia w roztworze i silna adsorpcja powodująca niskie stężenie, którego nie można dokładnie określić. Jeśli stosuje się substancję etykietowaną izotopowo, ekstrakcji z gleby można zapobiec, za pomocą analizy fazy gleby przez spalanie i obliczenie scyntylacji na cieczowym liczniku. Jednakże cieczowy licznik scyntylacyjny jest techniką nieokreśloną, która nie może rozróżnić między macierzystymi a przekształconymi produktami; dlatego musi być używana tylko wtedy, jeżeli badana substancja chemiczna jest stabilna w czasie trwania badań.

1.5. INFORMACJE DOTYCZĄCE SUBSTANCJI BADANEJ

Odczynniki chemiczne powinny być czystości analitycznej. Zalecane jest użycie nieetykietowanych substancji badanych o znanym składzie i czystości co najmniej 95% lub etykietowanych izotopami substancji badanych o znanym składzie oraz radioczystości. W przypadku wskaźników o krótkim czasie półtrwania należy zastosować poprawki na rozkład.

Przed przeprowadzeniem badania adsorpcji-desorpcji powinny być dostepne nastepujące informacje o badanej substancji:

a) rozpuszczalność w wodzie (A.6);

b) ciśnienie pary (A.4) i/lub stała Henry'ego;

c) rozkład abiotyczny: hydroliza jako funkcja pH (C.7);

d) współczynnik podziału (A.8);

e) szybka biodegradacja (C.4) lub aerobowe i anaerobowe przekształcenia w glebie;

f) pKa niezjonizowanych substancji;

g) bezpośrednia fotoliza w wodzie (tj. UV-Vis widmo absorpcji w wodzie, wydajność kwantowa) i fotodegradacja na glebie.

1.6. MOŻLIWOŚĆ ZASTOSOWANIA BADANIA

Badanie ma zastosowanie do substancji chemicznych, dla których jest dostępna analityczna metoda z dostateczną dokładnością. Ważnym parametrem wpływającym na wiarygodność wyników, w szczególności kiedy stosowana jest metoda pośrednia, jest stabilność substancji badanej w zakresie czasu badania. Dlatego wstepnym warunkiem jest sprawdzenie stabilności we wstępnych badaniach, jeśli obserwuje się przekształcenie w skali czasu badania, zalecane jest aby prowadzono główne badania poprzez analizę zarówno gleby, jak i fazy wodnej.

Trudności w prowadzeniu niniejszego badania powstają w odniesieniu do substancji badanych o niskiej rozpuszczalności w wodzie (Sw < 10^-4 g l^-1), jak również w odniesieniu do wysoce naładowanych substancji, spowodowych przez fakt, że stężenie w fazie wodnej nie może być zmierzone analitycznie z wystarczającą dokładnością. W tych przypadkach należy podjąć dodatkowe czynności. Wytyczne dotyczące sposobu postępowania z takimi problemami podano we właściwych punktach niniejszej metody.

Przy badaniu lotnych substancji należy zachować ostrożność, by zapobiec stratom w czasie trwania badania.

1.7. OPIS METODY

1.7.1. Aparatura i odczynniki chemiczne

Zwykły sprzęt laboratoryjny, w szczególności następujące urządzenia:

a) Probówki lub zbiorniki do prowadzenia doswiadczeń. Istotne jest, aby te probówki i zbiorniki:

- pasowały bezpośrednio do aparatury wirówki w celu zminimalizowania manipulacji i przenoszenia błędów,

- były wykonane z obojętnego materiału o minimalnej adsorpcji badanej substancji na jego powierzchni.

b) Urządzenie do mieszania: podwieszany wibrator lub równoważny osprzęt, utrzymujący glebę w postaci zawiesiny.

c) Wirówka: zalecana wysokoobrotowa, na przykład siła odwirowania > 3.000 g, kontrolowana odnośnie do temperatury, zdolna do usuwania cząstek o srednicy większej niż 0,2 μm z roztworu wodnego. Pojemniki powinny być zamykane w czasie wirowania i mieszania w celu uniknięcia zmian i strat wody; w celu zminimalizowania adsorpcji na nich należy użyć nieaktywne zamknięcia, na przykład pokrywki śrubowe z teflonu.

d) Fakultatywnie: urządzenie filtracyjne; filtry o porowatości 0,2 μm, sterylne, jednorazowego użytku. Należy zwrócić szczególną uwagę przy wyborze materiału filtra, aby uniknąć jakichkolwiek strat na nim; w odniesieniu do słabo rozpuszczalnych substancji badanych nie zaleca się filtra z materiału organicznego.

e) Analityczne oprzyrządowanie, odpowiednie do pomiarów stężenia badanej substancji chemicznej.

f) Suszarka laboratoryjna, zdolna utrzymać temperaturę od 103° C do 110° C.

1.7.2. Scharakteryzowanie i wybór gleb

Gleby powinny być scharakteryzowane przez trzy parametry uważane za w dużej mierze odpowiedzialne za zdolności adsorpcyjne: wegiel organiczny, zawartość gliny i tekstura gleby oraz pH. Jak już wspomniano (patrz zakres), inne fizykochemiczne właściwości gleby wpływają na adsorpcję/desorpcję określonych substancji i powinny być rozważone w takich przypadkach.

Metody używane do scharakteryzowania gleby są bardzo istotne oraz posiadają znaczący wpływ na wyniki. Dlatego jest zalecane, aby pH gleby było mierzone w roztworze 0,01 M CaCl₂ (jest to roztwór używany w badaniach adsorpcja/desorpcja) zgodnie z odpowiednią metodą ISO (ISO-10.390-1). Jest także zalecane, aby inne stosowne właściwości gleby były ustalane zgodnie ze standardowymi metodami (na przykład "Handbook of Soil Analysis" ISO); pozwala to na oparcie analizowanych danych sorpcji, na globalnie znormalizowanych parametrach gleby. Niektóre wytyczne dotyczące istniejących standardowych metod analiz gleby i jej charakterystykę podano w bibliografii (50-52). W odniesieniu do kalibracji metod badania gleby zalecane jest stosowanie gleb odniesienia.

Wytyczne dotyczące wyboru gleb do doświadczeń adsorpcja/desorpcja podano w tabeli 1. Siedem wybranych gleb pokrywa typy gleb spotykane w różnych strefach geograficznych. Dla podatnych na jonizację substancji badanych wybrane gleby powinny pokrywać szeroki zakres pH w celu umożliwienia oceny adsorpcji substancji w jej zjonizowanych i niezjonizowanych formach. Wytyczne dotyczące tego, jak wiele różnych gleb należy użyć na róznych stadiach badania, podano w ppkt 1.9. Wykonanie badania.

Jeśli inne typy gleb są preferowane, powinny one charakteryzować się tymi samymi parametrami i powinny mieć zbliżone zmiany we właściwościach do tych opisanych w tabeli 1, nawet jeśli nie zestawiają one dokładnie kryteriów.

Tabela 1: Wytyczne dotyczące wyboru próbek gleby dla adsorpcji/desorpcji

Typ gleby	Zakres pH (w 0,01 M CaCl₂)	Zawartość węgla organicznego (%)	Zawartość gliny (%)	Tekstura gleby ⁽¹⁾
1	4,5-5,5	1,0-2,0	65-80	glina
2	> 7,5	3,5-5,0	20-40	glina formierska
3	5,5-7,0	1,5-3,0	15-25	muł formierski
4	4,0-5,5	3,0-4,0	15-30	ił
5	< 4,0-6,0 ⁽²⁾	< 0,5-1,5 ^{(2) (3)}	< 10-1 5 ⁽²⁾	piasek formierski
6	>7,0	< 0,5-1,0 ^{(2) (3)}	40-65	glina ił/glina
7	<4,5	>10	< 10	piasek/piasek formierski
⁽¹⁾ Zgodnie z FAO i systemem US (85). ⁽²⁾ Odpowiednie zmienne powinny wykazywać wartości w ramach podanego zakresu. Jednakże jeśli występują trudności ze znalezieniem właściwego materiału gleby, wartości poniżej wskazują akceptowalne minimum. ⁽³⁾ Gleby z mniej niż 0,3 % węgla organicznego mogą zakłócać korelacje miedzy organiczną zawartością a adsorpcją. Jest zalecane użycie gleb o minimalnej zawartości węgla organicznego 0,3 %.

1.7.3. Zbieranie i przechowywanie próbek gleby

1.7.3.1. Zbieranie

Nie ma specjalnych technik ani narzędzi zalecanych do pobierania próbek; technika pobierania próbek zależy od celu badania (53) (54) (55) (56) (57) (58).

Należy rozważyć:

a) szczegółowe informacje dotyczące historii pola są konieczne, obejmują umiejscowienie, rodzaje wegetacji, traktowanie pestycydami i/lub nawozami, dodatki biologiczne lub przypadkowe zanieczyszczenia. Zalecenia normy ISO dotyczące pobierania próbek (ISO 10381-6) powinny zostać spełnione w odniesienia do opisu miejsca pobierania próbek;

b) miejsce pobierania próbek musi być określone przez UTM (uniwersalne poprzeczne odwzorowanie Mercatora - europejski poziom geodezyjny) lub współrzędne geograficzne; może to umożliwić ponowne zebranie określonej gleby w przyszłości lub może pomóc w określeniu gleby w różnych systemach klasyfikacyjnych używanych w różnych krajach. Zbierana powinna być gleba z poziomu A do maksymalnej głębokości do 20 cm. W szczególności w odniesieniu do gleb typu n. 7 jeśli poziom O_h jest obecny jako część gleby, która powinna być włączona przy zbieraniu próbek.

Próbki gleby powinny być przetransportowane z użyciem pojemników i w warunkach temperatury, które zapewniają, aby początkowe właściwości gleby nie zostały zmienione w znaczący sposób.

1.7.3.2. Przechowywanie

Zalecane jest użycie tylko świeżo pobranych gleb z pola. Tylko w przypadkach gdy jest to niemożliwe, gleba jest przechowywana w temperaturze otoczenia oraz powinna być wysuszona powietrzem. Nie ma zalecanej granicy czasu przechowywania, lecz gleby przechowywane dłużej niż trzy lata powinny być ponownie przeanalizowane przed użyciem w odniesieniu do ich zawartości węgla organicznego, pH i CEC.

1.7.3.3. Postępowanie i przygotowanie próbek gleby do badań

Gleby są suszone powietrzem w temperaturze otoczenia (zalecane 20-25° C). Rozdrobnienie powinno być prowadzone z minimalną siłą, tak aby pierwotna tekstura gleby zmieniła się tak niewiele, jak to możliwe. Gleby przesiewa się do wielkości cząstki ≤ 2 mm; zalecenia normy ISO dotyczące pobierania próbek gleby (ISO 10381-6) powinny być spełnione w odniesieniu do procesu przesiewania. Zalecana jest staranna homogenizacja, gdyż poprawia to odtwarzalność wyników. Zawartość wilgoci w każdej glebie jest określana z trzech podwielokrotności ogrzewanych w temperaturze 105° C do zaniku występowania znaczących różnic wagi (około 12 godzin). W odniesieniu do wszystkich obliczeń masa gleby oznacza wysuszoną w suszarce suchą masę, tj. wagę gleby skorygowaną o zawartość wilgoci.

1.7.4. Przygotowanie substancji użytej w badaniu do zastosowania na glebę

Substancja badana jest rozpuszczona w roztworze 0,01 M CaCl₂ w destylowanej lub dejonizowanej wodzie; roztwór CaCl₂ stosuje się jako rozpuszczalnik fazy wodnej do poprawy odwirowania i zminimalizowania wymiany kationowej. Zalecane stężenie roztworu podstawowego powinno być trzy rzędy wyższe niż granica wykrywalności stosowanej metody analitycznej. Niniejszy próg gwarantuje dokładne pomiary w odniesieniu do metodologii stosowanej w niniejszej metodzie; ponadto stężenie roztworu podstawowego powinno być poniżej rozpuszczalności w wodzie badanej substancji.

Roztwór podstawowy powinien być przygotowany tuż przed zastosowaniem do próbek gleby oraz powinien być on trzymany zamknięty w ciemności w 4° C. Czas przechowywania zależy od stabilności substancji badanej i jej stężenia w roztworze.

Tylko w odniesieniu do słabo rozpuszczalnych substancji (S_w < 10^-4 g l^-1), gdy trudno rozpuścić substancję badaną, potrzebny może być środek ułatwiający rozpuszczenie. Środek ułatwiający rozpuszczenie: a) powinien być mieszalny z wodą, jak też z metanolem lub acetonitrylem; b) jego stężenie nie powinno przekraczać 1% całkowitej objętości roztworu podstawowego i powinno stanowić mniej niż to w roztworze substancji badanej, która wchodzi w kontakt z glebą (zalecany mniej niż 0,1%); oraz c) nie powinien być środkiem powierzchniowoczynnym lub ulegać solwolitycznym reakcjom z badaną substancją. Użycie środka ułatwiającego rozpuszczanie powinno być przewidziane i usprawiedliwione przy przedstawianiu danych.

Inną alternatywą dla słabo rozpuszczalnych substancji jest dodanie substancji badanej do systemu badanego przez wybijanie: substancja badana jest rozpuszczona w organicznym rozpuszczalniku, jej podwielokrotność do systemu gleby, a 0,01 M roztworu CaCl₂ w destylowanej lub dejonizowanej wodzie. Zawartość rozpuszczalnika w fazie wodnej powinna być tak niska, jak to możliwe, zwykle nie przekracza 0,1%. Wybijanie z roztworu organicznego może ulec objętościowej nieodtwarzalności. Dlatego wprowadza się dodatkowy błąd, tak że stężenie substancji badanej i korozpuszczalnika nie jest takie samo we wszystkich badaniach.

1.8. WARUNKI WSTĘPNE PRZEPROWADZANIA BADANIA ADSORPCJI/DESORPCJI

1.8.1. Metoda analityczna

Kluczowe parametry wpływające na dokładność pomiarów sorpcji obejmują: dokładność metody analitycznej w analizie obu roztworów i faz adsorbowanych, stabilność i czystość substancji badanej, osiągnięcie równowagi sorpcji, rozpiętość zmian stężenia roztworu, stosunek gleba/roztwór i zmiany w strukturze gleby w czasie trwania procesu równowagi (35) (59-62). Niektóre przykłady dotyczące danych dokładności podano w dodatku 2.

Wiarygodność używanej metody analitycznej musi być sprawdzona w zakresie stężeń, które prawdopodobnie wynikną w trakcie badania. Eksperymentator powinien czuć się swobodnie, aby rozwijać odpowiednie metody z właściwą dokładnością, precyzją, odtwarzalnością, granicami wykrywalności i je poprawiać. Wytyczne dotyczące tego, w jaki sposób należy prowadzić takie badania, podano w doświadczeniu poniżej.

Właściwa objętość 0,01 M CaCl₂, np. 100 cm³, jest mieszana w ciągu 4 h z odważką gleby, np. 20 g, o wysokiej adsorbowalności, tj. z wysoką zawartością węgla organicznego oraz gliny; te odważki i wielkości zmieniają się w zależności od potrzeb analitycznych, lecz stosunek gleba/roztwór wynoszący 1:5 jest dogodnym punktem początkowym. Mieszaninę odwirowuje się, a fazę wodną filtruje. Pewną objętość roztworu podstawowego substancji badanej dodaje się do drugiej dla uzyskania nominalnego stężenia w zakresie stężenia, które prawdopodobnie wystąpi w czasie trwania badania. Objętość ta nie powinna przekraczać 10% końcowej objętości fazy wodnej w celu zmiany w najmniejszym możliwym zakresie charakteru roztworu przedrównowagowego. Roztwór poddaje się analizie.

Ślepa próba, składająca się z systemu gleba + roztwór CaCl₂ (bez substancji badanej) musi być włączona w celu sprawdzenia artefaktów w metodzie analitycznej oraz dla macierzystych efektów powodowanych przez glebę.

Analityczne metody, które mogą być stosowane do pomiarów sorpcji, zawierają chromatografię gazowo-cieczową (GLC), wysokiej rozdzielczości chromatografię cieczową (HPLC), spektrometrię (np. spektrometria GC/masa, spektrometria HPLC/masa) i cieczową scyntylacyjną (w odniesieniu do substancji etykietowanych izotopami). Niezależnie od używanych metod analitycznych, jest uznane za odpowiednie, jeśli wykrywalność wynosi między 90% a 110% wartości nominalnej. W celu umożliwienia wykrycia oraz oceny po zajściu podziału granice wykrywalności metody analitycznej powinny być co najmniej dwa rzędy wielkości poniżej stężenia nominalnego.

Cechy i granice wykrywalności metody analitycznej dostępnej do przeprowadzenia badań adsorpcji mają istotną rolę w określaniu warunków badania i całego doświadczalnego przeprowadzenia badania. Niniejsza metoda wskazuje ogólną doświadczalną drogę, dostarcza zaleceń i wytycznych dotyczących rozwiązań alternatywnych, w przypadku gdy metoda analityczna i laboratoryjne środki mogą nakładać ograniczenia.

1.8.2. Wybór optymalnych proporcji gleba/roztwór

Wybór właściwych proporcji gleby do roztworu w badaniach sorpcji zależy od współczynnika podziału K_d oraz względnego stopnia pożądanej adsorpcji. Zmiana stężenia substancji w roztworze określa statystyczną dokładność pomiaru opartego na kształcie równania adsorpcji i granicy analitycznej metodologii w wykrywaniu stężenia substancji chemicznej w roztworze. Dlatego w praktyce ogólnej jest użyteczne ustalenie kilku proporcji, w odniesieniu do których procent adsorpcji wynosi powyżej 20%, a zalecany > 50% (62), ponieważ należy dążyć do utrzymania stężenia substancji badanej w wodnej fazie wystarczająco wysoko, aby mogło być ono zmierzone dokładnie. Jest to szczególnie istotne w przypadku wysokiego procentu adsorpcji.

Dogodne podejście do wyboru właściwej proporcji gleba/woda jest oparte na szacowaniu wartości K_d przez badania wstępne albo przez ustalone techniki szacowania (dodatek 3). Wybór właściwej proporcji dokonywany jest na podstawie wykresu proporcji gleba/roztwór w zależności od K_d w odniesieniu do ustalonego procenta adsorpcji (rys. 1). W tym wykresie przyjęto, że równanie adsorpcji jest liniowe⁽¹⁾. Stosowana zależność jest uzyskiwana przez przekształcenie równania (4) dla K_d do postaci równania (1):

grafika

Rys. 1. Zależność między stosunkami gleba do roztworu i K_d przy różnych procentach zaadsorbowanej substancji badanej

Rysunek 1 przedstawia proporcje gleba/roztwór jako funkcje K_d dla różnych poziomów adsorpcji. Na przykład przy proporcji gleba/roztwór 1:5 i K_d 20, zachodzi w przybliżeniu 80% adsorpcji. Dla uzyskania 50% adsorpcji dla tego samego K_d należy zastosować proporcję 1:25. Takie podejście do wyboru właściwych proporcji gleba/roztwór daje badaczowi elastyczność w spełnieniu doświadczalnych wymagań.

Dziedziny, które są trudniejsze do rozwiązania, są tymi, w których substancja chemiczna jest wysoce adsorbowana lub bardzo nieznacznie. W przypadku wystepowania niskiej adsorpcji stosunek 1:1 gleba/roztwór jest zalecany, chociaż w odniesieniu do niektórych bardzo organicznych typów gleb konieczne są mniejsze proporcje do uzyskania zawiesiny. Analityczna metodologia do pomiaru małych zmian stężeń w roztworach musi być stosowana z ostrożnością; inaczej pomiar adsorpcji będzie niedokładny. Z drugiej strony, bardzo wysokie współczynniki podziału K_d, dochodzące do 1:100 stosunek gleba/roztwór w celu pozostawienia znaczącej ilości substancji w roztworze. Jednakże należy zwrócić uwagę na zapewnienie dobrego mieszania oraz odpowiedniego czasu na dojście systemu do równowagi. Alternatywnym podejściem do rozwiązania takich ekstremalnych przypadków, gdy brakuje stosownej metodologii analitycznej, jest przewidywanie wartości K_d w zastosowaniu technik oceny, opartych na przykład, o wartościach P_ow (dodatek 3). Może to być przydatne w szczególności w odniesieniu do nisko adsorbowalnych polarnych substancji chemicznych o P_ow < 20 oraz dla lipofilowych, wysoce sorpcyjnych substancji o P_ow > 10⁴.

1.9. WYKONANIE BADANIA

1.9.1. Warunki badania

Wszystkie doświadczenia są wykonywane w temperaturze otoczenia oraz, jeśli to możliwe, w stałej temperaturze między 20° C a 25° C.

Warunki odwirowania powinny umożliwić usunięcie z roztworu cząstek większych niż 0,2 μm. Ta wartość oddziela cząstki najmniejszych rozmiarów, uważanych za cząstkę stałą i jest granicą między stałą i koloidalną cząstką. Wytyczne dotyczące sposobu określania warunków odwirowania podano w dodatku 4.

Jeśli udogodnienia w zakresie odwirowania nie mogą zapewnić usunięcia cząstek większych od 0,2 μm, stosowana może być kombinacja odwirowania oraz filtracji przez filtr 0,2 μm. Filtry te powinny być wykonane z odpowiedniego obojętnego materiału, zapobiegającego stratom na nim. W każdym przypadku należy udowodnić, że nie powstają na nim jakiekolwiek straty substancji badanej podczas trwania filtracji.

1.9.2. Warstwa 1 - Badania wstępne

Cel prowadzenia badań wstępnych podano już w punkcie dotyczącym zakresu. Wytyczne dotyczące określania takiego badania wraz z doświadczeniem sugerowanym podano poniżej.

1.9.2.1. Wybór optymalnych proporcji gleba/roztwór

Używa się dwa typy gleby i trzy proporcje gleba/roztwór (sześć doświadczeń). Jeden rodzaj gleby ma wysoką zawartość węgla organicznego i gliny, druga niską zawartość węgla organicznego i gliny. Sugerowane są nastepujące proporcje gleby do roztworu:

- 50 g gleby i 50 cm³ roztworu wodnego substancji badanej (proporcja 1/1),

- 10 g gleby i 50 cm³ roztworu wodnego substancji badanej (proporcja 1/5),

- 2 g gleby i 50 cm³ roztworu wodnego substancji badanej (proporcja 1/25).

Minimalna ilość gleby, przy której przeprowadza się doświadczenie, zależy od możliwości laboratorium i wykonania zastosowanych metod analitycznych. Jednakże jest zalecane użycie co najmniej 1 g, a najlepiej 2 g, w celu uzyskania wiarygodnych wyników badania.

Jedna próbka kontrolna jedynie z substancją badaną w roztworze 0,01 M CaCl₂ (bez gleby) podlega dokładnie tym samym kolejnym czynnościom, jak badane systemy, w celu sprawdzenia stabilności badanej substancji w roztworze CaCl₂ i możliwej adsorpcji na powierzchni badanego zbiornika.

Ślepa próba gleby z taką samą ilością gleby i całkowitej objętości 50 cm³ roztworu 0,01 M CaCl₂ (bez substancji badanej) podlega takiej samej procedurze badania. Służy to jako dodatkowa kontrola w czasie trwania analizy mającej na celu wykrycie zakłócających substancji lub zanieczyszczonych gleb.

Wszystkie doświadczenia, łącznie z próbami ślepymi i kontrolnymi, powinny być wykonane przynajmniej z duplikatem. Całkowita ilość próbek, które powinny być przygotowane do badań, mogą być obliczone w odniesieniu do metodologii, która zastanie zastosowana.

Metody w zakresie badań wstępnych i badania główne są ogólnie takie same, wyjatki są wspomniane tam, gdzie to jest odpowiednie.

Wysuszone powietrzem próbki gleby są równoważone przez wytrząsanie minimalną objętością 45 cm³ 0,01 M CaCl₂ w ciągu nocy (12 h) przed dniem doświadczenia. Nastepnie dodaje się pewną ilość roztworu podstawowego substancji badanej w celu dostosowania końcowej objętości do 50 cm³. Objętość dodanego roztworu podstawowego: a) nie powinna przekroczyć 10% końcowej objetości 50 cm³ fazy wodnej w celu zmiany, w możliwie najmniejszym zakresie charakteru roztworu przed równowagą; oraz b) powinna zdecydowanie wpływać na wyniki początkowego stężenia substancji badanej będącej w kontakcie z glebą (C₀) co najmniej dwa rzędy wielkości więcej niż granica wykrywalności metody analitycznej; niniejszy próg zabezpiecza możliwość prowadzenia dokładnych pomiarów, nawet gdy zachodzi silne adsorpcja (> 90%) i określenia późniejszych izoterm adsorpcji. Zaleca się również, jeśli to możliwe, aby początkowe stężenie substancji (C₀) nie przekraczało połowy jej granicy rozpuszczalności.

Przykład sposobu obliczenia stężenia roztworu podstawowego (C_st) podano poniżej. Przyjęto granicę wykrywalności 0,01 μg cm^-3 i 90% adsorpcji; zatem zalecane wstępne stężenie substancji badanej w kontakcie z glebą powinno wynosić 1 μg cm^-3 (dwa rzędy wielkości wyższe niż granica wykrywalności). O ile dodano zalecaną maksymalną objętość roztworu podstawowego, tj. od 5 do 45 cm³ 0,01 M CaCl₂, roztworowa równowaga (= 10% roztworu podstawowego do 50 cm3 całkowitej objętości fazy wodnej), stężenie roztworu podstawowego powinno wynosić 10 μg cm^-3, to jest trzy rzędy wielkości wyższej niż granica wykrywalności metody analitycznej.

Wartość pH fazy wodnej powinna być mierzona przed i po kontakcie z glebą, ponieważ ma to istotne znaczenie w całkowitym procesie adsorpcji, w szczególności w odniesieniu do jonizowalnych substancji.

Mieszanina jest wytrząsana do osiagnięcia równowagi adsorpcji. Czas równowagi w glebach jest wysoce zmienny w zależności od substancji chemicznej i gleby; okres 24 godzin jest ogólnie wystarczający (77). W badaniach wstepnych próbki mogą być zbierane sekwencyjnie przez 48 godzin okresu mieszania (np. w 4, 8, 24, 48 godzin). Jednakże czas analizy powinien być określony elastycznie w odniesieniu do rozkładu pracy laboratorium.

Istnieją dwie możliwości w odniesieniu do analizy substancji badanej w roztworze wodnym: a) metoda równoległa i b) metoda seryjna. Należy pokreślić, że chociaż metoda równoległa jest doświadczalnie bardziej uciążliwa, to matematyczne opracowanie wyników jest prostsze (dodatek 5). Jednakże wybór metodologii która ma być zastosowana, pozostawiona jest eksperymentatorowi, który musi rozważyć dostępne urządzenia i zasoby laboratorium.

a) Metoda równoległa: przygotowuje się próbki w tej samej proporcji gleba/roztwór, w liczbie zależnej od tego, w ilu przedziałach czasowych chce się zbadać kinetykę adsorpcji. Po odwirowaniu i, jeśli jest to pożądane, po filtracji faza wodna z pierwszej probówki jest usuwana możliwie całkowicie i mierzona po, na przykład 4 godzinach, druga probówka po 8 godzinach, trzecia po 24 godzinach itd.

b) Metoda seryjna: przygotowuje się tylko kopie próbek w odniesieniu do każdej proporcji gleba/roztwór. W określonych przedziałach czasu mieszanina jest wirowana w celu rozdzielenia faz. Mała podwielokrotność fazy wodnej jest niezwłocznie analizowana w odniesieniu do substancji badanej; nastepnie doświadczenie prowadzi się nadal z orginalną mieszaniną. Jeśli zastosowano filtrację po odwirowaniu, laboratorium powinno posiadać urządzenia umożliwiające przeprowadzenie filtracji małych wodnych podwielokrotności. Zalecane jest, aby całkowite podwielokrotności pobrane nie przekraczały 1% całkowitej objętości roztworu, w celu niepowodowania znaczących zmian proporcji gleba/roztwór i zmniejszenia masy rozpuszczonej zdolnej do adsorpcji w czasie trwania badania.

Procentowa adsorpcja A_ti jest obliczana w każdym punkcie czasu (t_i) na podstawie nominalnego początkowego stężenia i zmierzonego stężenia w chwili pobierania próbek (t_i), skorygowana w odniesieniu do wartości ślepej próby. Wykresy A_ti w zależnosci od czasu (rys. 1 dodatek 5) są generowane w celu oszacowania osiągnięcia plateau równowagowego.⁽²⁾ Wartość K_d w równowadze jest również obliczana. Na podstawie tej wartości K_d właściwe proporcje gleba/roztwór są wybierane z rys. 1, tak aby procent adsorpcji osiągał powyżej 20%, a zalecane > 50% (61). Wszystkie mające zastosowanie równania i zasady wykreślania podano w punkcie "Dane i sprawozdawczość" oraz w dodatku 5.

1.9.2.2. Określenie czasu równowagi adsorpcji i ilości badanej substancji zaadsorbowanej w równowadze

Jak już wspomniano, wykresy A_ti lub C_aq^ads w zależności od czasu pozwalają oszacować osiągnięcie równowagi adsorpcji i ilości badanej substancji zaadsorbowanej w równowadze. Rys. 1 i 2 w dodatku 5 wskazują przykłady takich wykresów. Czas równowagi jest czasem potrzebnym systemowi do osiągnięcia plateau.

Jeśli przy określonej glebie nie występuje plateau, tylko stały wzrost, może być to spowodowane czynnikami zakłócajacymi, takimi jak biodegradacja lub powolne rozproszenie. Biodegradacja może być wykazana przez powtórzenie doświadczenia ze sterylizowaną próbką gleby. Jeśli nie uzyskano plateau nawet w tym przypadku, eksperymentator powinien poszukiwać innych zjawisk, które mogły wpłynąć na to szczególne badanie; może to być dokonane z właściwymi zmianami warunków doświadczenia (temperatura, czas wytrząsania, proporcje gleba/roztwór). Pozostawia się do uznania ekperymentatora, czy stosować nadal procedurę badania pomimo możliwości nieuzyskania równowagi.

1.9.2.3. Adsorpcja na powierzchni zbiornika badanego i stabilność substancji użytej w badaniu

Niektóre informacje dotyczące adsorpcji substancji badanej na powierzchni badanego zbiornika, jak również dotyczące jej stabilności są wyprowadzane poprzez analizowanie próbek kontrolnych. Jeżeli obserwuje się uszczuplenie większe niż standardowy błąd metody analitycznej, może to świadczyć o abiotycznej degradacji i/lub adsorpcji na powierzchni badanego zbiornika. Rozróżnienie między tymi dwoma zjawiskami może być uzyskane przez gruntowne mycie ścian zbiornika znaną ilością właściwego rozpuszczalnika oraz przez poddanie roztworu z mycia analizie w odniesieniu do substancji badanej. Jeśli nie obserwuje się adsorpcji na powierzchni zbiornika badanego, uszczuplenie oznacza abiotyczną niestabilność substancji badanej. Jeśli wykryto adsorpcję, konieczna jest zmiana materiału zbiornika badanego. Jednakże danych dotyczących adsorpcji na powierzchni badanego zbiornika, uzyskanych w wyniku tego doświadczenia nie można bezpośrednio ekstrapolować do doświadczenia gleba/roztwór. Obecność gleby oddziałuje na tę adsorpcję.

Dodatkowe informacje dotyczące stabilności substancji badanej mogą być uzyskane przez określenie macierzystego bilansu masy w czasie. Oznacza to, że faza wodna, ekstrakt z gleby i ścianki zbiornika badanego są analizowane w odniesieniu do substancji badanej. Różnica między masą badanych substancji chemicznych dodanych a sumą mas badanych substancji chemicznych w fazie wodnej, ekstraktów z gleby i ścianek zbiornika badanego jest równa masie zdegradowanej i/lub ulotnionej, i/lub nieekstrahowanej. W celu dokonania określenia bilansu masy równowaga adsorpcyjna powinna być osiągnięta w czasie doświadczenia.

Bilans masy wykonuje sie na obu glebach i w odniesieniu do jednej proporcji gleba/roztwór na glebę, co daje uszczuplenie ponad 20% i zalecane > 50% w równowadze. Po zakończeniu doświadczenia znalezienia proporcji z analizą ostatniej próbki wodnej fazy po 48 godzinach fazy są rozdzielane przez odwirowanie i, jeśli jest to pożądane, filtrowane. Faza wodna jest w najszerszym możliwym zakresie odzyskiwana oraz dodany jest odpowiedni rozpuszczalnik ekstrakcyjny (współczynnik ekstrakcji co najmniej 95%) do gleby, aby wyekstrahować substancję badaną. Zaleca się co najmniej dwie kolejne ekstrakcje. Ilość substancji badanej w ekstrakcie z gleby i zbiornika badanego jest określana, a bilans masy oblicza się (równanie 10, Dane i sprawozdawczość). Jeżeli jest mniejszy niż 90%, substancję badaną uznaje się za niestabilną w skali czasu badania. Jednakże badania mogą nadal być prowadzone, uwzględniając niestabilność substancji badanej, w tym przypadku zalecane jest analizowanie obu faz w badaniu głównym.

1.9.3. Warstwa 2 - Kinetyka adsorpcji przy jednym stężeniu substancji badanej

Stosuje się pięć typów gleb, wybranych z tabeli 1. Zaletą jest, że można włączyć niektóre lub wszystkie gleby użyte w badaniach wstępnych, jeśli to stosowne, spośród tych pięciu gleb. W tym przypadku warstwa 2 nie zostaje powtórzona w odniesieniu do gleb użytych w badaniach wstępnych.

Czas równowagi, stosunek gleba/roztwór, waga próbki gleby, objętość fazy wodnej w kontakcie z glebą oraz stężenie substancji badanej w roztworze są wybierane na podstawie wyników badań wstępnych. Zalecane jest, aby analiza została wykonana po około 2, 4, 6, 8 (możliwie także 10) i 24 h czasu kontaktu; czas mieszania może być przedłużony do maksimum 48 h w przypadku substancji chemicznej wymagającej dłuższego czasu równowagi w odniesieniu do wyników poszukiwania proporcji. Jednakże czas analizy należy rozważyć elastycznie.

Każde doświadczenie (jedna gleba i jeden roztwór) jest co najmniej raz kopiowane, aby umożliwić oszacowanie odchylenia wyników. W każde doświadzenie włączona jest ślepa próba. Obejmuje to glebę i roztwór 0,01 M CaCl₂, bez substancji badanej, odpowiednio wagę oraz objętość identyczne do tych z doświadczenia. Kontrolna próbka tylko z substancją badaną w roztworze 0,01 M CaCl₂ (bez gleby) podlega tej samej procedurze badania, służąc jako zabezpieczenie przed nieoczekiwanym.

Procent adsorpcji jest obliczany w każdym punkcie czasu A_ti i/lub przedziale czasowym A_Δ_ti (wedle potrzeby) i jest wykreślany w zależności od czasu. Współczynnik podziału K_d w równowadze, jak również znormalizowany współczynnik adsorpcji węgla organicznego K_oc (w odniesieniu do niepolarnych substancji chemicznych organicznych) są również obliczane.

Wyniki badania adsorpcji kinetycznej

Liniowa wartość K_d jest zasadniczo dokładna, aby opisać zachowanie sorpcyjne w glebie (35) (78), i przedstawia wyrażenie mobilności właściwej substancji chemicznej w glebie. Na przykład ogólnie w substancjach chemicznych o K_d ≤ 1 cm³ g^-1 są uznawane za jakościowo mobilne. Podobnie schemat klasyfikacji mobilności na podstawie wartości K_oc został rozwinięty przez MacCall et al. (16). Dodatkowo schematy klasyfikacji wypłukiwania istnieją na podstawie zależności między K_oc a DT-50 ⁽³⁾ (32) (79).

Również zgodnie z badaniami analizy błędów (61) wartości K_d poniżej 0,3 cm³ g^-1 nie można oszacować dokładnie z obniżenia stężenia w fazie wodnej, nawet jeżeli najbardziej korzystny (z punktu widzenia dokładności) stosunek gleba/roztwór, tj. 1:1 zastosowano. Zaleca się w tym przypadku analizę obu faz, gleby i roztworu.

W odniesieniu do powyższych uwag jest zalecane, aby badania zachowania adsorpcyjnego substancji chemicznych w glebie i ich potencjalna mobilność były nadal prowadzone przez oznaczanie izoterm adsorpcji Freundlicha dla tych systemów, dla których możliwe jest oznaczenie K_d, wraz z protokołem doświadczalnym zastosowanym w niniejszej metodzie badania. Dokładne oznaczenie jest możliwe, jeżeli wartość, która wynika z pomnożenia K_d i proporcji gleba/roztwór jest > 0,3, gdy pomiary są oparte na spadku stężenia w wodnej fazie (metoda pośrednia), lub > 0,1, gdy analizowane są obie fazy (metoda bezpośrednia) (61).

1.9.4. Warstwa 3 - Izotermy adsorpcji i kinetyka desorpcji/izotermy desorpcji

1.9.4.1. Izotermy adsorpcji

Używa się pięć stężeń substancji badanej, obejmujące najlepiej dwa rzędy wielkości; przy wyborze tych stężeń powinny być uwzględnione rozpuszczalność w wodzie i wynikła stężeniowa równowaga wodna. W trakcie badań musi być zachowany ten sam stosunek gleba/roztwór. Badanie adsorpcji jest prowadzone, jak opisano powyżej, z tą tylko różnicą, że faza wodna jest analizowana tylko raz w czasie niezbędnym do osiągnięcia równowagi, jak ustalono wcześniej w warstwie 2. Stężenia równowagowe w roztworze są określone, a ilość zaadsorbowana jest obliczona z uszczuplenia substancji badanej w roztworze lub metodą bezpośrednią. Zaadsorbowana masa na jednostkę masy gleby jest wykreślana jako funkcja stężenia równowagi badanej substancji (patrz: "Dane i sprawozdawczość").

Wyniki z doświadczenia izoterm adsorpcji

Z matematycznych modeli adsorpcji dotąd proponowanych izoterma Freundlicha jest jedną z najczęściej stosowanych do opisu procesów adsorpcji. Bardziej szczegółowe informacje dotyczące interpretacji i ważności modelu adsorpcji są określone w bibliografii (41) (45) (80) (81) (82).

Uwaga: Należy wspomnieć, że porównanie wartości K_F (współczynnik adsorpcji Freundlicha) w odniesieniu do różnych substancji jest tylko możliwe, gdy te wartości K_F są wyrażone w tych samych jednostkach (83).

1.9.4.2. Kinetyka desorpcji

Celem tego doświadczenia jest zbadanie, czy substancja chemiczna jest odwracalnie czy nieodwracalnie adsorbowana w glebie. Niniejsza informacja jest istotna, ponieważ proces desorpcji również ma istotne znaczenie w zachowaniu się substancji chemicznych w glebie pól. Ponadto dane w zakresie desorpcji są użyteczne jako dane wejściowe w komputerowym modelowaniu symulacji przebiegu rozpuszczania i płukania. Jeśli badania desorpcji są pożądane, jest zalecane, aby badania opisane poniżej były prowadzone na każdym systemie, dla którego dokładne oznaczenie K_d w poprzedzającym doświadczenie kinetyki adsorpcji było możliwe.

Podobnie jak w badaniach kinetyki adsorpcji, istnieją dwie możliwości wykonania doświadczenia kinetyki desorpcji: a) metoda równoległa i b) metoda seryjna. Wybór zastosowanej metodologii pozostawia się uznaniu eksperymentatora, który musi uwzględnić dostępne urządzenia i zasoby laboratorium.

a) Metoda równoległa: w odniesieniu do każdej gleby wybranej do przeprowadzenia badań desorpcji przygotowuje sie próbki o tej samej proporcji gleba/roztwór, w liczbie zależnej od tego, w ilu przedziałach czasowych chce się zbadać kinetyki desorpcji. Powinno się użyć tych samych przedziałów czasowych, jak w doświadczeniu kinetyki adsorpcji; jednakże całkowity czas może być przedłużony, jeśli to właściwe, w celu osiągnięcia przez system równowagi desorpcji. W każdym doświadczeniu (jedna gleba, jeden roztwór) włącza się ślepą próbę. Obejmuje to glebę i roztwór 0,01 M CaCl₂, bez substancji badanej, odpowiednio naważkę oraz objętość identyczne do tych z doświadczenia. Kontrolna próbka tylko z substancją badaną w roztworze 0,01 M CaCl₂ (bez gleby) podlega tej samej procedurze badania. Wszystkie mieszaniny gleby z roztworem są mieszane do osiągnięcia równowagi adsorpcji (jak wcześniej określono w warstwie 2). Następnie fazy są rozdzielane przez odwirowanie, a fazy wodne są usuwane w najszerszym możliwym zakresie. Objętość oddzielonego roztworu jest zastępowana przez równą objętość 0,01 M CaCl₂ bez substancji badanej, a nowe mieszaniny są ponownie mieszane. Faza wodna z pierwszej probówki jest usuwana całkowicie, jak to możliwe, i mierzona po, na przykład 2 h, druga probówka po 4 godzinach, trzecia po 6 godzinach itd. do osiągniecia równowagi desorpcji.

b) Metoda seryjna: po doświadczeniu kinetyki adsorpcji mieszanina jest odwirowana i faza wodna jest usuwana w najszerszym możliwym zakresie. Objętość roztworu usuniętego jest zastępowana przez równą objętość 0,01 M CaCl₂ bez substancji badanej. Nowa mieszanina jest mieszana do osiągniecia równowagi desorpcji. W trakcie tego okresu, w określonych przedziałach czasowych, mieszanina jest odwirowywana w celu rozdzielenia faz. Mała podwielokrotność fazy wodnej jest niezwłocznie analizowana w odniesieniu do substancji badanej; nastepnie doświadczenie prowadzi się nadal z pierwotną mieszaniną. Objętość każdej poszczególnej podwielokrotności powinna być mniejsza niż 1% całkowitej objetości. Taka sama ilość swieżego roztworu 0,01 M CaCl₂ jest dodawana do mieszaniny w celu utrzymania proporcji gleby do roztworu, a mieszanie jest kontynuowane do nastepnego przedziału czasowego.

Procent desorpcji jest obliczany w każdym punkcie czasu (D_ti) i/lub przedziale czasowym (D_Δti) (wedle potrzeb badania) i jest wykreślana w zależności od czasu. Współczynnik desorpcji K_des w równowadze jest także obliczany. Wszystkie mające zastosowanie równania podano w dodatku 5 i "Dane i sprawozdawczość".

Wyniki z doświadczenia kinetyki desorpcji

Wspólne wykreślenie procentu desorpcji D_ti i adsorpcji A_ti w zależnosci od czasu umożliwia oszacowanie odwracalności procesu adsorpcji. Jeśli równowaga desorpcji jest osiągana nawet w obrębie podwojonego czasu równowagi adsorpcji, a całkowita desorpcja jest wieksza niż 75% ilości adsorbowanej, adsorpcja jest uważana za odwracalną.

1.9.4.3. Izotermy desorpcji

Izotermy desorpcji Freundlicha są określone na glebach używanych w doświadczeniu izoterm adsorpcji. Badanie desorpcji jest prowadzone, jak opisano w punkcie "Kinetyka desorpcji", z tą tylko różnicą, że faza wodna analizowana jest tylko raz, w równowadze desorpcji. Ilość substancji badanej zdesorbowanej jest obliczana. Zawartość substancji badanej pozostajacej zaadsorbowaną na glebie w równowadze desorpcji jest wykreślana jako funkcja stężenia równowagi substancji badanej w roztworze (patrz: "Dane i sprawozdawczość" oraz dodatek 5).

2. DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ

Dane analityczne są przedstawione w formie tabelarycznej (patrz dodatek 6). Podano poszczególne pomiary i obliczone średnie. Pokazano graficzne przedstawienie izoterm adsorpcji. Dokonanie obliczeń opisano poniżej.

Do celów badania uznaje się że waga 1 cm³ roztworu wodnego wynosi 1 g. Stosunek gleba/roztwór wyrażony w jednostkach wag./wag. lub wag./obj. jest tą samą liczbą.

2.1. ADSORPCJA

Adsorpcja (A_ti) jest określona jako procent substancji zaadsorbowanej na glebie w proporcji do ilości na początku badania w warunkach badania. Jeśli substancja badana jest stabilna i nie adsorbuje się w znacznym stopniu na ściankach zbiornika, A_ti oblicza się w każdym punkcie czasu t_i, zgodnie z równaniem:

grafika

Szczegółowe informacje dotyczące sposobu obliczenia procenta adsorpcji A_ti dla metody równoległej i seryjnej podano w dodatku 5.

Współczynnik podziału K_d jest proporcją między zawartością substancji w fazie gleby i masowym stężeniem substancji w roztworze wodnym, w warunkach badania, gdy osiągnięta jest równowaga adsorpcji.

grafika

Znormalizowany współczynnik adsorpcji węgla organicznego K_oc wiąże współczynnik podziału K_d z zawartością węgla organicznego próbki gleby:

grafika

Współczynnik K_oc przedstawia pojedyńczą wartość, która charakteryzuje podzielenie głównie niepolarnych substancji organicznych między węglem organicznym w glebie lub osadzie i wodzie. Adsorpcja tych substancji chemicznych jest skorelowana z zawartością związków organicznych sorbującego ciała stałego (7); zatem wartości K_oc zależą od właściwych cech próchnicowych frakcji, które różnią się znacznie zdolnością sorpcji z powodu różnic w pochodzeniu, genezie itd.

2.1.1. Izotermy adsorpcji

Równanie izoterm Freundlicha wiąże ilość substancji badanej zaadsorbowanej ze stężeniem substancji badanej w roztworze w równowadze (równanie 8).

Dane są opracowywane jak w "Adsorpcja" i, w odniesieniu do każdej probówki badanej, zawartość substancji badanej zaadsorbowanej na glebie po badaniu adsorpcji (C_s^ads(eq), gdzie indziej oznaczane jako as x/m) jest obliczana. Przyjmując, że równowaga została osiągnięta i że C_s^ads(eq) przedstawia wartość równowagi

grafika

Równania (8) i (9) są wykreślane i wartości K_F^ads i 1/n są wyliczane analizą regresyjną, z zastosowaniem równania 9. Współczynnik korelacji r² równania logarytmicznego jest również wyliczany. Przykład takich wykresów podano na rys. 2.

grafika

Rys. 2. Wykres adsorpcji Freundlicha, normalny i linearyzowany

2.1.2. Bilans masy

Bilans masy (MB) określa się jako procent substancji, który może być analitycznie odzyskany po badaniu adsorpcji w zalezności od nominalnej ilości substancji na początku badania.

Opracowywanie danych rozróżni, czy rozpuszczalnik jest całkowicie mieszalny z wodą. W przypadku rozpuszczalników mieszalnych z wodą opracowanie danych opisanych pod "Desorpcja" może być stosowane do określenia ilości substancji odzyskanej przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem. Jeśli rozpuszczalnik jest słabo mieszalny z wodą, określenie odzyskanej ilości musi być dokonane.

Bilans masy MB w odniesieniu do adsorpcji jest obliczany następująco; przyjmuje się, że pojęcie (m_E) odpowiada sumie badanych mas substancji chemicznych wyekstrahowanych z gleby i powierzchni zbiornika badanego rozpuszczalnikiem organicznym:

grafika

2.2. DESORPCJA

Desorpcję (d) określa się jako procent substancji badanej zdesorbowanej w zależności od ilości substancji uprzednio zaadsorbowanej, w warunkach badania:

grafika

Szczegółowe informacje dotyczące sposobu obliczenia procentu desorpcji D_ti dla metody równoległej i seryjnej podano w dodatku 5.

Pozorny współczynnik desorpcji (K_des) jest, w warunkach badania, proporcją między zawartością substancji pozostającą w fazie gleby a stężeniem masowym substancji desorbowanej w roztworze wodnym, gdy osiągnięta jest równowaga desorpcji:

grafika

Wytyczne dotyczące obliczania m_aq^des(eq) podano w dodateku 5 pod pozycją "Desorpcja".

Uwaga:

Jeśli badanie adsorpcji, które było poprzedzające było wykonane metodą równoległą objętość V_r w równaniu 12 uznaje się za równe V₀.

2.2.1. Izotermy desorpcji

Równanie izoterm desorpcji Freundlicha wiąże zawartość substancji badanej pozostającej zaadsorbowanej na glebie ze stężeniem substancji badanej w roztworze w równowadze desorpcji (równanie 16).

W odniesieniu do każdej probówki badanej zawartość substancji pozostającej zaadsorbowaną na glebie, w równowadze desorpcji, jest obliczana następująco:

grafika

Równania 16 i 17 mogą być wykreślone, a wartości K_F^des i 1/n są obliczane za pomocą analizy regresyjnej, stosując równanie 17.

Uwaga:

Jeśli wykładnik 1/n adsorpcji lub desorpcji Freundlicha jest równy 1, stałe wiążące adsorpcję lub desorpcję Freundlicha (K_F^adsi K_F^des)K_des, będą równe odpowiednio stałym równowagi adsorpcji lub desorpcji (K_d i K_des), a wykresy C_s vs C_aq będą liniowe. Jeśli wykładniki nie są równe 1, krzywe C_s vs C_aq będą nieliniowe, a stałe adsorpcji i desorpcji będą się zmieniać wzdłuż izoterm.

2.2.2. Sprawozdanie z badania

Sprawozdanie z badania musi zawierać nastepujące informacje:

- Pełna identyfikacja użytych próbek gleby, włączając:

- geograficzne odniesienie miejsca (szerokość geograficzna, długość geograficzna),

- datę pobierania próbek,

- użyty rodzaj (np. gleba rolnicza, leśna itd.),

- głębokość pobierania próbek,

- zawartość piasek/muł/glina,

- wartości pH (w 0,01 M CaCl₂),

- zawartość węgla organicznego,

- zawartość substancji organicznych,

- zawartość azotu,

- stosunek C/N,

- zdolność wymiany kationu (mmol/kg),

- wszystkie informacje odnoszące się do zbierania i przechowywania próbek,

- tam, gdzie to jest stosowne, wszystkie istotne informacje dotyczące interpretacji adsorpcja/desorpcja substancji badanej,

- bibliografia dla metod zastosowanych dla oznaczenia każdego parametru,

- informacje dotyczące substancji badanej, jeśli to stosowne,

- temperatura doświadczeń,

- warunki odwirowania,

- procedura analityczna zastosowana do analizy substancji badanej,

- uzasadnienie w odniesieniu do każdego użycia środka ułatwiającego rozpuszczanie do przygotowania roztworu właściwego substancji badanej,

- wyjaśnienie korekt wykonanych w obliczeniach, jeśli to odpowiednie,

- dane zgodnie z formularzem (dodatek 6) wraz z prezentacją graficzną,

- wszystkie informacje i obserwacje pomocne dla interpretacji wyników badania.

3. BIBLIOGRAFIA

(1) Kukowski H. and Brümmer G., (1987). Investigations on the Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. UBA Report 106 02.045, Part II.

(2) Fränzle O., Kuhnt G. and Vetter L., (1987). Selection of Representative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 02 045, Part I.

(3) Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, Collection, Treatment, Characterisation. Special Publication No 1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, ISPRA, December 1994.

(4) OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995 (June 1995).

(5) US Environment Protection Agency: Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate, Series 163-1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, Addendum 6 on Data Reporting, 540/09-88-096, Date: 1/1988.

(6) US Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 835-Fate, Transport and Transformation Test Guidelines, 0PPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/Desorption Isotherm. EPA No: 712-C-96-048, April 1996.

(7) ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for Determining a Sorption Constant (K_oc) for an Organic Chemical in Soil and Sediments.

(8) Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987.

(9) Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): Application for registration of a pesticide. Section G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.

(10) Danish National Agency of Environmental Protection (October 1988): Criteria for registration of pesticides as especially dangerous to health or especially harmful to the environment.

(11) BBA (1990), Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, Biological Research Centre for Agriculture and Forestry, Braunschweig, Germany.

(12) Calvet R., (1989), "Evaluation of adsorption coefficients and the prediction of the mobilities of pesticides in soils", in Methodological Aspects of the Study of Pesticide Behaviour in Soil (ed. P. Jamet), INRA, Paris, (Review).

(13) Calvet R., (1980), "Adsorption-Desorption Phenomena" in Interactions between herbicides and the soil. (R. J. Hance ed.), Academic Press, London, pp. 83-122.

(14) Hasset J. J., and Banwart W. L., (1989), "The sorption of nonpolar organics by soils and sediments" in Reactions and Movement of Organic Chemicals in Soils. Soil Science Society of America (S. S. S. A), Special Publication no. 22, pp. 31-44.

(15) van Genuchten M. Th., Davidson J. M., and Wierenga P. J., (1974), "An evaluation of kinetic and equilibrium equations for the prediction of pesticide movement through porous media". Soil Sci. Soc. Am. Proc., Vol. 38(1), pp. 29-35.

(16) McCall P. J., Laskowski D. A., Swann R. L., and Dishburger H. J., (1981), "Measurement of sorption coefficients of organic chemicals and their use, in environmental fate analysis", in Test Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxicants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington DC.

(17) Lambert S. M., Porter P. E., and Schieferrstein R. H., (1965), "Movement and sorption of chemicals applied to the soil". Weeds, 13, pp. 185-190.

(18) Rhodes R. C., Belasco I. J., and Pease H. L., (1970), "Determination of mobility and adsorption of agrochemicals in soils". J. Agric. Food Chem., 18, pp. 524-528.

(19) Russell M. H., (1995), "Recommended approaches to assess pesticide mobility in soil" in Environmental Behavior of Agrochemicals (ed. T. R. Roberts and P. C. Kearney). John Wiley & Sons Ltd.

(20) Esser H. O., Hemingway R. J., Klein W., Sharp D. B., Vonk J. W. and Holland P. T., (1988), "Recommended approach to the evaluation of the environmental behavior of pesticides", IUPAC Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, pp. 901-932.

(21) Guth J. A., Burkhard N., and D. O. Eberle, (1976), "Experimental models for studying the persistence of pesticides in soils". Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, pp. 137-157, BCPC, Surrey, UK.

(22) Furminge C. G. L., and Osgerby J. M., (1967), "Persistence of herbicides in soil". J. Sci. Fd Agric., 18, pp. 269-273.

(23) Burkhard N., and Guth J. A., (1981), "Chemical hydrolysis of 2-Chloro-4,6-bis(alkylamino)-1,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption". Pestic. Sci. 12, pp. 45-52.

(24) Guth J. A., Gerber H. R., and Schlaepfer T., (1977), "Effect of adsorption, movement and persistence on the biological availability of soil-applied pesticides". Proc. Br. Crop Prot. Conf., 3, pp. 961-971.

(25) Osgerby J. M., (1973), "Process affecting herbicide action in soil". Pestic. Sci., 4, pp. 247-258.

(26) Guth J. A., (1972), "Adsorptions- und Einwascheverhalten von Pflanzenschutzmitteln in Böden". Schr. Reihe Ver. Wass. -Boden-Lufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, pp. 143-154.

(27) Hamaker J. W., (1975), "The interpretation of soil leaching experiments", in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R. Haque and V. H. freed), pp. 135-172, Plenum Press, NY.

(28) Helling C. S., (1971), "Pesticide mobility in soils". Soil Sci. Soc. Amer. Proc., 35, pp. 732-210.

(29) Hamaker J. W., (1972), "Diffusion and volatilization" in Organic chemicals in the soil environment (C. A. I. Goring and J. W. Hamaker eds), Vol. I, pp. 49-143.

(30) Burkhard N. and Guth J. A., (1981), "Rate of volatilisation of pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results with those determined in a laboratory model system". Pestic. Sci. 12, pp. 37-44.

(31) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R. F., and Enfield C. G., (1984), "Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses", in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, pp. 297-325, Acs Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC.

(32) Gustafson D. I., (1989), "Groundwater ubiquity score: a simple method for assessing pesticide leachability". J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), pp. 339-357.

(33) Leistra M., and Dekkers W. A., (1976). "Computed effects of adsorption kinetics on pesticide movement in soils". J. of Soil Sci., 28, pp. 340-350.

(34) Bromilov R. H., and Leistra M., (1980), "Measured and simulated behavior of aldicarb and its oxydation products in fallow soils". Pest. Sci., 11, pp. 389-395.

(35) Green R. E., and Karickoff S. W., (1990), "Sorption estimates for modeling", in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. H. H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., Book Series no. 2, pp. 80-101,

(36) Lambert S. M., (1967), "Functional relationship between sorption in soil and chemical structure". J. Agri. Food Chem., 15, pp. 572-576.

(37) Hance R. J., (1969), "An empirical relationship between chemical structure and the sorption of some herbicides by soils". J. Agri. Food Chem., 17, pp. 667-668.

(38) Briggs G. G., (1969), "Molecular structure of herbicides and their sorption by soils". Nature, 223, 1288.

(39) Briggs G. G., (1981), "Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor". J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050-1059.

(40) Sabljic A., (1984), "Predictions of the nature and strength of soil sorption of organic polutance by molecular topology". J. Agric. Food Chem., 32, pp. 243-246.

(41) Bailey G. W., and White J. L., (1970), "Factors influencing the adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil". Residue Rev., 32, pp. 29-92.

(42) Bailey G. W., J. L. White and Y. Rothberg., (1968), "Adsorption of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate". Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 32: pp. 222-234.

(43) Karickhoff S. W., (1981), "Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils". Chemosphere 10, pp. 833-846.

(44) Paya-Perez A., Riaz M. and Larsen B., (1989), "Soil Sorption of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners". Environ. Toxicol. Safety 21, pp. 1-17.

(45) Hamaker J. W., and Thompson J. M., (1972), "Adsorption in organic chemicals" in Organic Chemicals in the Soil Environment (Goring C. A. I. and Hamaker J. W., eds), Vol I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972, pp. 49-143.

(46) Deli J., and Warren G. F., (1971), "Adsorption, desorption and leaching of diphenamid in soils". Weed Sci. 19: pp. 67-69.

(47) Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J. M. and Santelmann, (1975), "Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils". Weed Science, Vol. 23, pp. 454-457.

(48) Haues M. H. B., Stacey M., and Thompson J. M., (1968), "Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic preparations" in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, p. 75, International. Atomic Energy Agency, Vienna.

(49) Pionke H. B., and Deangelis R. J., (1980), "Methods for distributing pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase", CREAMS, in A Field Scale Model for Chemicals, Run-off and Erosion from Agricultural Management Systems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Documentation, USDA Conservation Research report.

(50) ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality-General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition (1994).

(51) Scheffer F., and Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde, F. Enke Verlag, Stuttgart (1982), 11th edition.

(52) Black, Evans D. D., White J. L., Ensminger L. E., and Clark F. E., eds. "Methods of Soil Analysis", Vol 1 and 2, American Society of Agronomy, Madison, WI, 1982.

(53) ISO/DIS 10 381-1 Soil Quality-Sampling-Part 1: Guidance on the design of sampling programmes.

(54) ISO/DIS 10 381-2 Soil Quality-Sampling-Part 2: Guidance on sampling techniques.

(55) ISO/DIS 10 381-3 Soil Quality-Sampling-Part 3: Guidance on safety of sampling.

(56) ISO/DIS 10 381-4 Soil Quality-Sampling-Part 4: Guidance on the investigation of natural and cultivated soils.

(57) ISO/DIS 10 381-5 Soil Quality-Sampling-Part 5: Guidance on the investigation of soil contamination of urban and industrial sites.

(58) ISO 10 381-6, 1993: Soil Quality-Sampling-Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.

(59) Green R. E., and Yamane V. K., (1970), "Precision in pesticide adsorption measurements". Soil Sci. Am. Proc., 34, pp. 353-354.

(60) Grover R., and Hance R. J., (1970), "Effect of ratio of soil to water on adsorption of linuron and atrazine". Soil Sci., pp. 109-138.

(61) Boesten, J. J. T. I, "Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients in pesticide/soil system". Pest. Sci. 1990, 30, pp. 31-41.

(62) Boesten, J. J. T. I. "Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients in relation to OECD guideline 106". Proceedings of 5th international workshop on environmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brussels, 26-29 April 1994.

(63) Bastide J., Cantier J. M., et Coste C., (1980), "Comportement de substances herbicides dans le sol en fonction de leur structure chimique". Weed Res. 21, pp. 227-231.

(64) Brown D. S., and Flagg E. W., (1981), "Empirical prediction of organic pollutants sorption in natural sediments". J. Environ. Qual., 10(3), pp. 382-386.

(65) Chiou C. T., Porter P. E., and Schmedding D. W., (1983), "Partition equilibria of non-ionic organic compounds between soil organic matter and water". Environ. Sci. Technol., 17(4), pp. 227-231.

(66) Gerstl Z., and Mingelgrin U., (1984), "Sorption of organic substances by soils and sediments". J. Environm. Sci. Health, B19 (3), pp. 297-312.

(67) Vowles P. D., and Mantoura R. F. C., (1987), "Sediment-water partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons". Chemosphere, 16(1), pp. 109-116.

(68) Lyman W. J., Reehl W. F. and Rosenblatt D. H., (1990), Handbook of Chemical Property Estimation Methods. Environmental Behaviour of Organic Compounds. American Chemical Society, Washington DC.

(69) Keniga E. E., and Goring, C. A. I., (1980), "Relationship between water solubility, soil sorption, octanol-water partitioning and concentration of chemicals in the biota" in Aquatic Toxicology (eds J. G. Eaton, et al.), pp. 78-115, ASTM STP 707, Philadelphia.

(70) Chiou C. T., Peters L. J., and Freed V. H., (1979), "A physical concept of soil-water equilibria for non-ionic organic compounds". Science, Vol. 206, pp. 831-832.

(71) Hassett J. J., Banwart W. I., Wood S. G., and Means J. C., (1981), "Sorption of /-Naphtol: implications concerning the limits of hydrophobic sorption". Soil Sci. Soc. Am. J. 45, pp. 38-42.

(72) Karickhoff S. W., (1981), "Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils". Chemosphere, Vol. 10(8), pp. 833-846.

(73) Moreale A., van Bladel R., (1981), "Adsorption de 13 herbicides et insecticides par le sol. Relation solubilité-reactivité". Revue de l’Agric., 34 (4), pp. 319-322.

(74) Müller M., Kördel W., (1996), "Comparison of screening methods for the determination/estimation of adsorption coefficients on soil". Chemosphere, 32(12), pp. 2493-2504.

(75) Kördel W., Kotthoff G., Müller M., (1995), "HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test". Chemosphere 30 (7), pp. 1373-1384.

(76) Kördel W., Stutte J., Kotthoff G., (1993), "HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-comparison of different stationary phases". Chemosphere 27 (12), pp. 2341-2352.

(77) Hance R. J., (1967), "The Speed of Attainment of Sorption Equilibria in Some Systems Involving Herbicides". Weed Research, Vol. 7, pp. 29-36.

(78) Koskinen W. C., and Harper S. S., (1990), "The retention processes: mechanisms" in Pesticides in the Soil Environment: Processes, Impacts and Modelling (ed. H. H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin.

(79) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R. F., and Enfield C. G., (1984), "Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses", in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, pp. 297-325, ACS Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC.

(80) Giles C. H., (1970), "Interpretation and use of sorption isotherms" in Sorption and Transport Processes in Soils. S. C. I. Monograph No. 37, pp. 14-32.

(81) Giles C. H., McEwan J. H., Nakhwa S. N. and Smith D., (1960), "Studies in adsorption: XI. A system of classification of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of adsorption mechanisms and in measurements of pesticides surface areas of soils". J. Chem. Soc., pp. 3973-93.

(82) Calvet R., Tercé M., and Arvien J. C., (1980), "Adsorption des pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caractéristiques générales de l’adsorption". Ann. Agron. 31: pp. 239-251.

(83) Bedbur E., (1996), "Anomalies in the Freundlich equation", Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environment, 13-15 May 1996, Stratford-upon-Avon, UK.

(84) Guth J. A., (1985), "Adsorption/desorption", in Joint International Symposium, Physicochemical Properties and their Role in Environmental Hazard Assessment, July 1-3, Canterbury, UK.

(85) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).

⁽¹⁾

grafika

⁽²⁾Krzywa stężenia substancji badanej w fazie wodnej (C_aq^ads) w zależności od czasu może być również wykorzystana do oszacowania osiągnięcia plateau równowagowego (patrz rys. 2 w dodatku 5).

⁽³⁾DT - 50: czas degradacji dla 50% badanej substancj.

DODATEK 1

PLAN BADANIA

grafika

DODATEK 2

WPŁYW DOKŁADNOŚCI METODY ANALITYCZNEJ I ZMIAN STĘŻENIA NA DOKŁADNOŚĆ WYNIKÓW ADSORPCJI

grafika

DODATEK 3

TECHNIKI OSZACOWANIA DLA K_D

1. Techniki oszacowania pozwalają na przewidzenie Kd opartego na korelacjach z, na przykład wartością Pow (12) (39) (63-68), danymi dotyczącymi wodnej rozpuszczalności (12) (19) (21) (39) (68-73), lub danych polarności wyprowadzonych z zastosowania HPLC w fazie odwróconej (74-76). Jak wskazano w tabeli 1 i 2, istnieją K_oc lub K_om obliczone tymi równaniami i natępnie, pośrednio, K_d z równań:

grafika

2. Pojęcie tych korelacji jest oparte na dwóch założeniach: 1) jest to substancja organiczna gleby, która głównie wpływa na adsorpcje substancji i 2) współdziałania wywołane są głównie substancjami niepolarnymi. Jako wynik, te korelacje: 1) nie są, lub są tylko w pewnym zakresie stosowane do substancji polarnych, i 2) nie są stosowane w przypadkach gdy zawartość substancji organicznych w glebie jest bardzo mała (12). Dodatkowo, chociaż odkryto zadawalające korelacje między P_ow i adsorpcją (19), tego samego nie można powiedzieć o zależności między rozpuszczalnością w wodzie i zakresem adsorpcji (19) (21); tak więc badania są w istotnym stopniu sprzeczne.

3. Niektóre przykłady korelacji między współczynnikiem adsorpcji a współczynnikiem podziału oktanol-woda, jak również rozpuszczalność w wodzie, podano odpowiednio w tabeli 1 i 2.

Tabela 1. Przykłady korelacji między współczynnikiem podziału adsorpcji a współczynnikiem podziału oktanol-woda; dalsze przykłady w (12) (68)

Substancja	Korelacje	Autorzy
Podstawione moczniki	log K_om = 0,69 + 0,52 log P_ow	Briggs(1981) (39)
Aromatyczne chlorowane	log K_oc = - 0,779 + 0.904 log P_ow	Chiouetal. (1983) (65)
Różne pestycydy	log K_om = 4,4 + 0,72 log P_ow	Gerstl i Mingelgrin (1984) (66)
Aromatyczne węglowodory	log K_oc = -2,53 + 1,15 log P_ow	Vowles i Mantoura (1987) (67)

Tabela 2. Przykłady korelacji między współczynnikiem podziału adsorpcji i rozpuszczalnością w wodzie; dalsze przykłady patrz (68) (69)

Związki	Korelacje	Autorzy
Różne pestycydy	log K_om =3,8 -0,561 log S_w	Gerstl i Mingelgrin (1984) (66)
Alifatyczne, aromatyczne substancje chlorowane	log K_om = (4,040 +/-0,03 8) - (0,557 +/-0,012)log S_w	Chiou et al. (1979) (70)
a-naftol	log K_oc = 4,273 - 0,686 log S_w	Hasset et al. (1981) (71)
Cykliczne, alifatyczne aromatyczne	log K_oc = - 1,405 - 0,921 log Sw - 0,00.953(mp-25)	Karickhoff(1981)(72)
Różne związki	log K_om = 2,75 - 0,45 log S_w	Moreale van Blade (1982) (73)

DODATEK 4

OBLICZENIA W ODNIESIENIU DO OKREŚLENIA WARUNKÓW WIROWANIA

1. Czas odwirowania jest podany za pomocą następującego wzoru, właczając sferyczne cząstki:

grafika

W ogólnej praktyce stosuje się podwojony obliczony czas w celu zapewnienia całkowitego oddzielenia.

2. Równanie (1) może być uproszczone dalej, jeśli założymy że lepkość (η) i gęstość (ρ_aq) roztworu jest równa lepkości i gęstości wody w 25° C; zatem, η = 8,95 × 10^-3 g s^-1 cm^-1 i ρ_aq = 1,0 g, cm^-3.

Zatem czas wirowania jest podany za pomocą równania (2)

grafika

3. Z równania (2) jasno wynika, że dwa parametry są ważne dla określania warunków wirowania, tj. czas (t) szybkość (rpm), w celu uzyskania rozdzielenia cząstek o szczególnym wymiarze (w tym przypadku promień 0,1 μm ): 1) gęstość gleby oraz 2) długość mieszaniny w probówce wirówki (R_b-R_t), tj. odległość, którą przebywa cząstka z góry roztworu do dna probówki, oczywiście dla ustalonej objętości długość mieszaniny w probówce zależy od kwadratu promienia probówki.

4. Rysunek 1 przedstawia zmiany w czasie wirowania (t) w zależności od szybkości wirowania (rpm) dla różnych gęstości gleby (ρ_s) (rys. 1a) i różnych długości mieszaniny w probówkach wirówki (rys. 1b). Z rys. 1a wpływ gęstości gleby wynika w sposób oczywisty, na przykład dla klasycznego wirowania przy 3.000 rpm czas wirowania wynosi w przybliżeniu 240 min dla gęstości gleby 1,2 g cm³, podczas gdy jest to tylko 50 min dla 2,0 g cm³. Podobnie z rys. 1b dla klasycznego wirowania 3.000 rpm czas wirowania wynosi w przybliżeniu 50 min dla długości mieszaniny 10 cm i tylko 7 min dla długości 1 cm. Jednakże istotne jest odkrycie optymalnej zależności między wirowaniem, które wymaga możliwie mniejszej długości i ułatwionego postępowania eksperymentatora w rozdzielaniu faz po odwirowaniu.

5. Ponadto przy określaniu doświadczalnych warunków rozdzielania faz gleba/roztwór istotne jest rozważenie możliwości istnienia trzeciej "pseudofazy", koloidów. Cząstki te, o wielkości mniejszej niż 0,2 μm, mają ważny wpływ na cały mechanizm adsorpcji substancji w zawiesinie gleby. Gdy wirowanie jest wykonywane, jak opisano powyżej, koloidy pozostają w fazie wodnej i podlegają analizie wraz z wodną fazą. W ten sposób informacja o ich wpływie jest tracona.

Jeśli laboratorium prowadzące badanie posiada urządzenia ultrawirujące lub ultrafiltrujące, adsorpcja/desorpcja substancji w glebie może być badana dogłębniej, włączając informacje o adsorpcji substancji na koloidach. W tym przypadku należy zastosować ultrawirowanie przy 60.000 rpm/min lub ultrafiltrację z filtrem o porowatości 100.000 daltonów w celu rozdzielenia trzech faz gleby, koloidów i roztworu. Protokół badania powinien być również odpowiednio zmodyfikowany w celu objęcia wszystkich trzech faz analizą substancji.

grafika

Rys. 1a. Zmiany czasu wirowania (t) w zależności od szybkości wirowania (rpm) w odniesieniu do różnych gęstości gleb (ρ_s). R_t = 10 cm, R_b-R_t = 10 cm, η = 8,95 × 10^-3 g s^-1 cm^-1 i ρ_aq = 1,0 g cm^-3 przy 25 °C.

grafika

Rys. 1b. Zmiany czasu wirowania (t) w zależności od szybkości wirowania (rpm) w odniesieniu do różnych długości mieszaniny w probówce wirówki (R_b-R_t) = L; R_t = 10 cm, η = 8,95 × 10^-3 g s^-1 cm^-1, ρ_aq = 1,0 g cm^-3 przy 25 °C i ρ_s = 2,0 g cm^-3.

DODATEK 5

OBLICZANIE ADSORPCJI A (%) I DESORPCJI D (%)

Schemat czasowy procedury jest nastepujący:

grafika

W odniesieniu do wszystkich obliczeń zakłada się, że substancja badana jest stabilna i nie adsorbuje się w sposób znaczący na ściankach naczynia.

ADSORPCJA A (A%)

a) Metoda równoległa

Procent adsorpcji jest obliczany w odniesieniu do każdej probówki badanej (i) w każdym punkcie czasu (t_i), zgodnie z równaniem:

grafika

Człony niniejszego równania, są obliczane następująco:

grafika

Wartości procentu adsorpcji A_ti lub C_aq^ads(t_i) są wykreślane w zależności od czasu i czasu, po którym osiągana jest równowaga sorpcji. Przykłady takich wykresów podano odpowiednio na rys. 1 i rys. 2.

grafika

Czas równowagi t_i(h)

Rys. 1. Krzywa równowagi adsorpcji

grafika

Czas równowagi t_i(h)

Rys. 2. Stężenie masowe substancji badanej w fazie wodnej (C_aq) w zależności od czasu

b) Metoda szeregowa

Następujące równania są uwzględniane, jeśli zastosowano procedurę adsorpcji, przez oznaczenie substancji badanej w małych podwielokrotnościach fazy wodnej przy właściwych przedziałach czasu.

– W ramach każdego przedziału czasu ilość substancji zaadsorbowanej na glebie jest obliczana w następujący sposób:

– dla pierwszego przedziału czasu Δt₁ = t₁-t₀

grafika

– dla drugiego przedziału czasu Δt₂ = t₂-t₁

grafika

– for the third time interval Δt₃ = t₃-t₂

grafika

– for the n^th time interval Δt_n = t_n-t_n-1

grafika

– Procent adsorpcji w każdym przedziale czasowym, A_Δti, jest obliczany przez zastosowanie następującego równania:

grafika

gdzie procent adsorpcji (A_ti) w punkcie czasu t_i jest podany za pomocą równania:

grafika

Wartości adsorpcji A_ti lub A_Δti (w odniesieniu do potrzeb badania) są wykreślane w zależności od czasu i czasu, po którym uzyskana równowaga sorpcji jest stała.

– Przy czasie równowagi t_eq:

– masa substancji badanej zaadsorbowana na glebie wynosi:

grafika

⁽¹⁾

– masa substancji badanej w roztworze wynosi:

grafika

– i procent adsorpcji w równowadze wynosi:

grafika

Parametry użyte powyżej są określone jako:

grafika

DESORPCJA D (%)

Czas t₀ rozpoczęcia doświadczenia kinetyki desorpcji jest określany jako moment, w którym maksymalna odzyskana objętość roztworu badanej substancji (po osiągnięciu równowagi adsorpcji) jest podstawiana równą objętością roztworu 0,01 M CaCl₂ .

a) Metoda równoległa

W punkcie czasu t_i masa substancji badanej jest mierzona w fazie wodnej pobranej z probówki i (Vⁱ_r) i masa zdesorbowana jest obliczana według równania:

grafika

Masa substancji badanej zdesorbowanej podczas przedziału czasowego (Δt_i) jest podana za pomocą równania:

grafika

Procent desorpcji jest obliczany:

– w punkcie czasu t_i z równania:

grafika

– i podczas przedziału czasowego (Δ_ti) z równania:

grafika

Wielkości desorpcji D_ti lub D_Δti (zgodnie z potrzebami badań) są wykreślane w zależności od czasu i czasu po którym uzyskana równowaga desorpcji jest stała.

b) Metoda szeregowa

Następujące równania są uwzględniane, jeśli zastosowano procedurę adsorpcji, przez oznaczenie substancji badanej w małych podwielokrotnościach () fazy wodnej (metoda szeregowa w ppkt 1.9. "Wykonanie badania"). Zakłada ona, że: a) objętość nadsączu zlanego z probówki po doświadczeniu kinetyki adsorpcji była zastąpiona tą samą objętością roztworu 0,01 M CaCl₂ (V_R) i b) całkowita objętość fazy wodnej w kontakcie z glebą (V_T) w czasie trwania doświadczenia pozostaje stała oraz jest podana za pomocą równania:

grafika

W punkcie czasu t_i:

– masa substancji badanej jest mierzona w małej podwielokrotności (), a masa desorbowana jest obliczana według równania:

grafika

– w równowadze desorpcji t_i = t_eq a zatem

– procent desorpcji D_ti jest obliczony z następującego równania:

grafika

W przedziale czasowym (Δ_ti):

W trakcie każdego przedziału czasu ilość substancji desorbowanej jest obliczana następująco:

– dla pierwszego przedziału czasu Δt₁ = t₁-t₀

grafika

– dla pierwszego przedziału czasu Δt₂ = t₂-t₁

grafika

– dla n-tego przedziału czasu Δt_n = t_n-t_n-1

grafika

Ostatecznie procent desorpcji w każdym przedziale czasowym, D_Δti, jest wyliczany, stosując nastepujące równanie:

grafika

gdzie procent desorpcji D_ti w punkcie czasu t_i jest podany za pomocą równania:

grafika

gdzie powyższe użyte parametry są określone jako:

grafika

⁽¹⁾ Równanie ma zastosowanie do obu metod, bezpośredniej i pośredniej. Wszystkie inne równania stosowane są tylko dla metody pośredniej

DODATEK 6

ADSORPCJA-DESORPCJA W GLEBACH: ARKUSZ PRZEDSTAWIANIA DANYCH

grafika

C.19. OSZACOWANIE WSPÓŁCZYNNIKA ADSORPCJI (K_OC) NA GLEBIE I W OSADZIE ŚCIEKOWYM PRZY ZASTOSOWANIU WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ (HPLC)

1. METODA

Niniejsza metoda jest kopią OECD TG 121 (2000).

1.1. WPROWADZENIE

Zachowanie się sorpcji substancji w glebach lub osadach ściekowych może być opisane za pomocą parametrów określonych doświadczalnie w rozumieniu metody badania C.18. Ważnym parametrem jest współczynnik adsorpcji, który określa się jako stosunek między stężeniem substancji w gleba/osad ściekowy a stężeniem substancji w fazie wodnej w równowadze adsorpcji. Współczynnik adsorpcji znormalizowany do zawartości węgla organicznego gleby K_ocjest użytecznym wskaźnikiem zdolności wiązania substancji chemicznych na ciałach organicznych gleby i osadu ściekowego oraz pozwalającym na dokonanie porównań między różnymi substancjami chemicznymi. Niniejszy parametr może być oszacowany poprzez korelacje rozpuszczalności wodnej i współczynnikiem podziału n-oktanol/woda (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).

Metoda doświadczalna opisana w niniejszym badaniu używa HPLC dla oszacowania współczynnika adsorpcji K_oc w glebie i w osadzie ściekowym (8). Oceny są wyższej wiarygodności niż te z obliczeń QSAR (9). Jako metoda oszacowania nie może w pełni zastąpić doświadczeń okresowej równowagi, zastosowanej w metodzie badanej C.18. Jednakże oszacowany K_oc jest użyteczny dla wyboru właściwych parametrów badania dla badań adsorpcja/desorpcja zgodnie z metodą badania C.18, poprzez wyliczenie K_d (współczynnik podziału) lub K_f (współczynnik adsorpcji Freundlicha) zgodnie z równaniem 3 (patrz ppkt 1.2).

1.2. DEFINICJE

K_d: współczynnik podziału jest zdefiniowany jako stosunek stężenia równowagi C roztworu substancji badanej w systemie dwufazowym składającym się z sorbentu (gleba lub osad ściekowy) i fazy wodnej; jest to wartość bezwymiarowa, natomiast stężenia w obu fazach są wyrażone na podstawie waga/waga. W przypadku stężenia w fazie wodnej podano je na bazie waga/objętość, zatem jednostką jest ml * g^-1 * K_d zmienia się z właściwościami sorbentu i może być zależny od stężenia.

grafika

K_f: Współczynnik adsorpcji Freundlicha definiuje się jako stężenie substancji badanej w glebie lub osadzie ściekowym (x/m) gdy stężenie równowagi C_aq w fazie wodnej jest równe jeden; jednostką jest μg * g^-1 sorbenta. Wartość zmienia się z właściwościami sorbenta.

grafika

K_oc: Współczynnik podziału (K_d) lub współczynnik adsorpcji Freundlicha (K_f) znormalizowany do zawartości węgla organicznego (f_oc) sorbenta; w szczególności dla niezjonizowanych substancji chemicznych jest to przybliżony wskaźnik dla zasięgu adsorpcji między substancją a sorbentem, pozwalający na dokonanie porównań między różnymi substancjami chemicznymi. W zależności od wymiarów K_d i K_f, K_oc są bezwymiarowe lub mają jednostki ml * g^-1 lub μg * g^-1 ciała organicznego.

grafika

Zależność między K_oc i K_d nie zawsze jest liniowa i w ten sposób wartości K_oc mogą różnić się od gleby do gleby, ale ich różnorodność jest znacznie zmniejszona, porównując do wartości K_d lub K_f .

Współczynnik adsorpcji (K_oc) jest wyprowadzony ze współczynnika zdolności (k’) przy użyciu krzywej kalibracji, wykreślając log k’ w zależności od log K_oc wybranych związków odniesienia.

grafika

1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA

Wzór strukturalny, czystość, stała dysocjacji (jeśli to właściwe) powinny być znane przed zastosowaniem metody. Informacje dotyczące rozpuszczalności w wodzie i rozpuszczalnikach organicznych, współczynniku podziału oktanol-woda oraz cechy hydrolizy są przydatne.

Aby skorelować zmierzone przez HPLC dane retencji substancji badanej i jej współczynnik adsorpcji K_oc, ustalana jest krzywa kalibracji log K_oc w zależności od log k’. Powinno być zastosowane minimum sześć punktów odniesienia, co najmniej jeden powyżej i jeden poniżej wartości oczekiwanej substancji badanej. Dokładność metody będzie znacząco poprawiona, jeśli substancje wzorcowe są strukturalnie związane z zastosowaną substancją badaną. Jeśli takie dane nie są dostępne, jest zadaniem użytkownika wybranie właściwych substancji wzorcowych. W tym przypadku powinien zostać wybrany bardziej ogólny zestaw strukturalnie heterogenicznych substancji. Substancje stosowane i wartości K_ocsą wymienione w dodatku w tabeli 1 dotyczącej osadów ściekowych i w tabeli 3 dotyczącej gleb. Wybór innych substancji kalibracyjnych powinien być uzasadniony.

1.4. ZASADA METODY BADANIA

HPLC wykonuje się na analitycznych kolumnach napełnionych handlowo dostepnym cyjanopropylem w fazie stałej zawierajacej lipofilowe i polarne grupy cząsteczkowe. Umiarkowanie stacjonarna faza polarna jest oparta na stosowanej matrycy krzemionkowej:


- O- Si	- CH2 - CH2 - CH2	- CN
krzemionka	niepolarna połowa (odstęp)	polarna połowa

Zasada metody badania jest podobna do metody badania A.8 (współczynnik podziału, HPLC metoda). Podczas przejścia przez kolumnę wraz z ruchomą fazą substancja badana oddziałuje z fazą stacjonarną. W wyniku rozdzielenia między fazami ruchomą i stacjonarną badana substancja jest opóźniona. Podwójny skład fazy stacjonarnej posiadającej polarne i niepolarne powierzchnie pozwala na współdziałanie polarnych i niepolarnych grup cząsteczki w podobny sposób jak dla matryc ciał organicznych w glebie lub osadu ściekowego. Umożliwia to zależności między czasem retencji na kolumnie i współczynnikiem adsorpcji na powstających substancjach organicznych.

pH ma znaczacy wpływ na zachowania sorpcyjne, w szczególności w odniesieniu do substancji polarnych. W odniesieniu do gleb rolniczych lub zbiorników oczyszczalni ścieków, pH zwykle zmienia się między 5,5 a 7,5. Dla podatnych na jonizację substancji, należy wykonać dwa badania, zarówno z formą jonową, jak i niejonową we właściwych roztworach buforowych, ale tylko w przypadkach gdy co najmniej 10% związku badanego jest zdysocjowana w zakresie pH 5,5-7,5.

Ponieważ tylko zależność między retencją na kolumnie HPLC a współczynnikiem adsorpcji jest wykorzystywana do oceny, nie jest wymagana analityczna metoda ilościowa i konieczne jest określenie tylko czasu retencji. Jeśli dostępny jest odpowiedni zestaw substancji odniesienia i stosowane mogą być standardowe warunki doświadczalne, metoda stanowi szybki i skuteczny sposób oszacowania współczynnika adsorpcji K_oc.

1.5. MOŻLIWOŚĆ ZASTOSOWANIA BADANIA

Metoda HPLC ma zastosowanie do substancji chemicznych (nieetykietowanych lub etykietowanych), w odniesieniu do których jest dostępny właściwy system detakcji (np. spektrofotometer, detektor radioaktywności) i które są wystarczająco stabilne podczas czasu trwania doświadczenia. Może to być szczególnie użyteczne w odniesieniu do substancji chemicznych, które są trudne do badań w innych systemach doświadczalnych (tj. substancje lotne, substancje nierozpuszczalne w wodzie w stężeniu, które może być analitycznie zmierzone, substancje z wysokim powinowactwem do powierzchni systemów inkubacyjnych). Metoda jest użyteczna w odniesieniu do mieszanin dających pasma nierozuszczalnej elucji. W takim przypadku górne i dolne granice wartości log K_oc związków mieszaniny badanej powinny być określone.

Zanieczyszczenia mogą czasem powodować problemy dotyczące interpretacji wyników z HPLC, lecz mają małe znaczenie w zakresie, w jakim substancja badana może analitycznie być wyraźnie określona oraz oddzielana od zanieczyszczeń.

Metoda jest uzasadniona w odniesieniu do substancji wymienionych w tabeli 1 w dodatku oraz była również stosowana do różnych innych substancji chemicznych należących do nastepujących chemicznych klas:

- aminy aromatyczne (np. trifluralin, 4-chloroanilina, 3,5-dinitroanilina, 4-metyloanilina, N-metyloanilina, 1-naftyloamina),

- estry aromatycznych kwasów karboksylowych (np. metyloester kwasu benzoesowego, ester etylowy kwasu 3,5-dinitrobenzoesowego),

- węglowodory aromatyczne (np. toluen, ksylen, etylobenzen, nitrobenzen),

- estry kwasu aryloksyfenoksypropioniowego (np. diclofop-metylowy, fenoxaprop-etylowy, fenoxaprop-P-etylowy),

- środki grzybobójcze benzimidazolu i imidazolu (np. carbendazim, fuberidazol, triazoxid),

- amidy kwasu karboksylowego (np. 2-chlorobenzamid, N, N-dimetylobenzamid, 3,5-dinitrobenzamid, N-metylobenzamid, 2-nitrobenzamid, 3-nitrobenzamid),

- chlorowane węglowodory (np. endosulfan, DDT, heksachlorobenzen, quintozen, 1,2,3-trichlorobenzen),

- fosforoorganiczne środki owadobójcze (np. azinphos-metylowy, disulfoton, fenamiphos, isofenphos, pyrazophos, sulprofos, triazophos),

- fenole (np. fenol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol, pentachlorofenol, 2,4,6-trichlorofenol, 1-naftol),

- pochodne fenylomocznika (np. isoproturon, monolinuron, pencycuron),

- pigmentowe barwniki (np. Acid Yellow 219, Basic Blue 41, Direct Red 81),

- węglowodory poliaromatyczne (np. acetonaften, naftalen),

- środki chwastobójcze 1,3,5-triazyny (np. prometryn, propazine, simazine, terbutryn),

- pochodne triazolu (np. tebuconazole, triadimefon, tradimenol, triapenthenol).

Metody nie stosuje się do substancji, które reagują z eluentem albo z fazą stacjonarną. Nie jest także stosowana do substancji, które oddziaływują w szczególny sposób ze składnikami nieorganicznymi (np. tworzenie grup kompleksów z minerałami gliny). Metoda nie działa z substancjami powierzchniowoczynnymi, związkami nieorganicznymi i umiarkowanymi lub mocnymi organicznymi kwasami i zasadami. Wartości log K_oc w zakresie 1,5-5,0 mogą być określone. Podatne na jonizację substancje muszą być mierzone, stosując buforowaną fazę ruchomą, należy jednak zachować ostrożność, aby zapobieć strącaniu się składników buforu lub substancji badanej.

1.6. KRYTERIA JAKOŚCIOWE

1.6.1. Dokładność

Zwykle współczynnik adsorpcji substancji badanej może być szacowany w zakresie ± 0,5 log jednostki wartości określonej przez okresową metodę równowagi (patrz tabela 1 w dodatku). Wyższa dokładność może być uzyskana, jeśli substancje odniesienia zastosowane są strukturalnie związane z substancją badaną.

1.6.2. Powtarzalność

Oznaczenia powinny być prowadzone przynajmniej w dwóch kopiach. Wartości log K_oc wyprowadzone z poszczególnych pomiarów powinny mieścić się w zakresie 0,25 log jednostki.

1.6.3. Odtwarzalność

Doświadczenie uzyskane dotychczas przy zastosowaniu metody podtrzymuje jej zasadność. Badania metodą HPLC, z użyciem 48 substancji (głównie pestycydów), w odniesieniu do których były dostępne wiarygodne dane K_oc na glebach, dało współczynnik korelacji równy R = 0,95 (10) (11).

Miedzylaboratoryjne badanie porównawcze z 11 uczestniczącymi laboratoriami przeprowadzono, aby poprawić i uwiarygodnić metodę (12). Wyniki podano w tabeli 2 dodatku.

1.7. OPISANIE METODY BADANIA

1.7.1. Wstępne oszacowanie współczynnika adsorpcji

Współczynnik podziału oktanol-woda P_ow (= K_ow) oraz w pewnym zakresie wodna rozpuszczalność może być używana jako wskaźnik dla zasięgu adsorpcji w szczególności dla niejonowych substancji, a w ten sposób może być używana do wstępnego znalezienia zakresu. Rozmaitość przydatnych korelacji opublikowano w odniesieniu do kilku grup substancji chemicznych (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).

1.7.2. Aparatura

Wymagane są: cieczowy chromatograf połączony z bezpulsacyjną pompą i odpowiednim urządzeniem wykrywającym. Zalecane jest użycie zaworu wtryskowego z pętlą wtryskową. Należy użyć handlowego cyjanopropylu chemicznie związanego żywicą na bazie krzemionki (np. Hypersil i Zorbax CN). Kolumna ochronna z tego samego materiału może być ustawiona między systemem wtrysku i kolumną analityczną. Kolumny od różnych dostawców mogą różnić się znacznie w wydajności rozdzielania. Jako wytyczne powinny być osiągnięte następujące masowe proporcje podziału k':log k' > 0,0 dla log K_oc = 3,0 i log k' > 0,4 dla log K_oc = 2,0 przy użyciu metanol/woda 55/45% jako faza ruchoma.

1.7.3. Fazy ruchome

Zbadano kilka ruchomych faz i następujące dwie są zalecane:

- metanol/woda (55/45% obj.),

- metanol/0,01 M bufor cytrynianowy pH 6,0 (55/45% obj./obj.).

Metanol czystości HPLC oraz destylowana woda lub bufor cytrynianowy są używane do przygotowania elucyjnego rozpuszczalnika. Mieszanina jest odgazowywana przed użyciem. Powinna być używana elucja izokratyczna. Jeśli mieszaniny metanol/woda nie są właściwe, należy wypróbować inne mieszaniny rozpuszczalnik organiczny/woda, np. etanol/woda lub acetonitryl/woda. W odniesieniu do związków jonowych zaleca się użycie buforów w celu stabilizacji pH. Należy zachować ostrożność, aby zapobiec wytrącaniu się soli i uszkodzeniu kolumny, co zdarza się przy niektórych mieszaninach faza organiczna/bufor.

Nie można używać żadnych dodatków, takich jak odczynniki z wolną parą elektronową, ponieważ wpływają na właściowości sorpcji fazy stacjonarnej. Takie zmiany w fazie stacjonarnej są nieodwracalne. Z tej przyczyny obowiązkowe jest, aby doświadczenia z użyciem dodatków prowadzić w oddzielnych kolumnach.

1.7.4. Substancje rozpuszczone

Substancje badane i substancje odniesienia powinny być rozpuszczone w fazie ruchomej.

1.8. WYKONANIE BADANIA

1.8.1. Warunki badania

Temperatura w czasie trwania pomiarów powinna być rejestrowana. Użycie segmentu kolumny z kontrolowaną temperaturą jest silnie zalecane w celu zapewnienia stałych warunków w czasie trwania procesu kalibracji, oszacowania i pomiaru substancji badanej.

1.8.2. Oznaczenie czasu martwego t_o

Stosuje sie w odniesieniu do określenia czasu martwego dla dwóch różnych metod (patrz także ppkt 1.2).

1.8.2.1. Określenie czasu martwego t_o za pomocą serii homologicznych

Niniejsza procedura daje wiarygodne i standaryzowane wartości t_o. W zakresie szczegółowych informacji patrz metoda badania A.8: współczynnik podziału (n-oktanol/woda), metoda HPLC.

1.8.2.2. Określenie czasu martwego t_o substancjami obojętnymi, niezatrzymywanymi przez kolumnę

Niniejsza technika jest oparta na wtrysku roztworów formamidu, mocznika lub azotanu sodowego. Pomiary powinny być wykonane co najmniej dwa razy.

1.8.3. Oznaczanie czasów retencji t_R

Należy wybrać substancje odniesienia, jak opisano w ppkt 1.3. Są one wstrzykiwane jako mieszaniny wzorcowe dla ustalenia ich czasów retencji, upewniając się, że czas retencji każdego wzorca nie jest zakłócony przez obecność innego wzorca. Kalibracja powinna być wykonywana w regularnych odstępach czasu, co najmniej dwa razy dziennie, w celu wyjaśnienia niespodziewanych zmian w działaniu kolumny. Dla najlepszego sposobu wstrzyknięcia kalibracyjne powinny być prowadzone przed i po wstrzyknięciu badanej substancji w celu zapewnienia, aby czas retencji nie zmieniał się. Substancje badane są wstrzykiwane oddzielnie, w ilościach tak małych, jak to możliwe (aby zapobiec przeciążeniu kolumny) a ich czasy retencji są określone.

W celu podniesienia zaufania do pomiarów należy wykonać podwójne określenia. Wartości log K_oc uzyskane z poszczególnych pomiarów powinny wchodzić w zakres 0,25 log jednostki.

1.8.4. Ocena

Masowe proporcje podziału k' są obliczane od martwego czasu do czasów retencji t_R wybranych substancji odniesienia, według równania 4 (patrz ppkt 1.2). Dane log k' dotyczące substancji odniesienia są wykreślane względem ich wartości log K_oc z doświadczeń równowagi wsadowej podanych w tabeli 1 i 3 dodatku. Stosując niniejszy wykres, wartość log k' badanej substancji jest zatem używana do określania wartości log K_oc. Jeśli rzeczywiste wyniki wskazują, że log K_oc substancji badanej jest poza zakresem kalibracji, badanie należy powtórzyć, stosując inne, bardziej właściwe substancje odniesienia.

2. DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ

Sprawozdanie musi zawierać nastepujące informacje:

- identyczność substancji badanej i substancji odniesienia, ich czystość i wartości pK_a, jeśli to stosowne,

- opis wyposażenia i warunki działania, np. typ i wymiary kolumn analitycznych (z ochroną), sposoby wykrywania, faza ruchoma (proporcje składników i pH), zakres temperatur w czasie trwania pomiarów,

- czas martwy i zastosowana metoda jego określenia,

- ilość substancji badanej i substancji odniesienia wprowadzonej do kolumny,

- czas retencji różnych związków odniesienia użytych do kalibracji,

- szczegółowe informacje dotyczące spasowania linii regresji (log k’ vs log K_oc) i wykres linii regresji,

- dane średniej retencji i oszacowane wartości d log K_ocw odniesieniu do testowanego związku,

- chromatogramy.

3. BIBLIOGRAFIA

(1) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed). (1990). Handbook of chemical property estimation methods, Chap. 4, McGraw-Hill, New York.

(2) J. Hodson, N. A. Williams (1988). The estimation of the adsorption coefficient (K_oc) for soils by HPLC. Chemosphere, 17, 1 67.

(3) G. G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050-1059.

(4) C. T. Chiou, P. E. Porter, D. W. Schmedding (1983). Partition equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, pp. 227-231.

(5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic substances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19, pp. 297-312.

(6) C. T. Chiou, L. J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical concept of soil water equilibria for nonionic organic compounds, Science, 106, pp. 831-832.

(7) S. W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, pp. 833-846.

(8) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), pp. 121-128.

(9) M. Mueller, W. Kördel (1996). Comparison of screening methods for the estimation of adsorption coefficients on soil. Chemosphere, 32(12), pp. 2493-2504.

(10) W. Kördel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphere, 27(12), pp. 2341-2352.

(11) B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measurements and experience with the applicability of the modified OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, pp. 285-304.

(12) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), pp. 1373-1384.

DODATEK

TABELA 1

Porównanie wartości K_oc w odniesieniu do gleb i osadu ściekowego oraz obliczone wartości metodą rozdzielania HPLC ⁽¹⁾⁽²⁾

Substancja	Nr CAS	Log K_oc osad kanalizacyjny	Log K_oc HPLC	Δ	Log K_oc gleba	Log K_oc HPLC	Δ
Atrazyna	1912-24-9	1,66	2,14	0,48	1,81	2,20	0.39
Linuron	330-55-2	2,43	2,96	0,53	2,59	2,89	0,30
Fention	55-38-9	3,75	3,58	0,17	3,31	3,40	0,09
Monuron	150-68-5	1,46	2,21	0,75	1,99	2,26	0,27
Fenantren	85-01-8	4,35	3,72	0,63	4,09	3,52	0,57
Fenyloester kwasu benzoesowego	93-99-2	3,26	3,03	0,23	2.87	2,94	0,07
Benzamid	55-21-0	1,60	1,00	0,60	1,26	1,25	0,01
4-nitrobenzamid	619-80-7	1,52	1,49	0,03	1,93	1,66	0,27
Acetanilid	103-84-4	1,52	1,53	0,01	1,26	1,69	0,08
Anilina	62-53-3	1,74	1,47	0,27	2,07	1,64	0,43
2, 5-dichloroanilina	95-82-9	2,45	2,59	0,14	2,55	2,58	0,03
⁽¹⁾ W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), pp. 121-128. ⁽²⁾ W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludges. Chemosphere, 35 (1/2), pp. 107-119.

TABELA 2

Wyniki interlaboratoryjnego badania porównawczego (11 uczestniczących laboratoriów) przeprowadzonego w celu poprawy i uwiarygodnienia metody HPLC ⁽¹⁾

Substancja	Nr CAS	Log K_oc (OECD 106)	K_oc	Log K_oc
Substancja	Nr CAS	Log K_oc (OECD 106)	[metoda HPLC]
Atrazyna	1912-24-9	1,81	78 ± 16	1,89
Monuron	150-68-5	1,99	100 ± 8	2,00
Triapenthenol	77608-88-3	2,37	292 ± 58	2,47
Linuron	330-55-2	2,59	465 ± 62	2,67
Fention	55-38-9	3,31	2062 ± 648	3,31
⁽¹⁾ W. Kördel, C. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefflcient on soilresults of a ring test. Chemosphere, 30(7), pp. 1373-1384

TABELA 3

Zalecane substancje odniesienia dla metody przeglądowej HPLC opartej o dane adsorpcji gleby

Substancja wzorcowa	Nr CAS	Log K_oc średnie wartości od równowagi wsadowej	Liczba danych K_oc	Log S. D.	Źródło
Acetanilid	103-84-4	1,25	4	0,48	^(a)
Fenol	108-95-2	1,32	4	0,70	^(a)
2-nitrobenzamid	610-15-1	1,45	3	0,90	^(b)
N, N-dimetylobenzamid	611-74-5	1,52	2	0,45	^(a)
4-rnetylobenzamid	619-55-6	1,78	3	1,76	^(a)
Benzoesan metylu	93-58-3	1,80	4	1,08	^(a)
Atrazyna	1912-24-9	1,81	3	1,08	^(c)
Isoproturon	34123-59-6	1,86	5	1,53	^(c)
3-nitrobenzamid	645-09-0	1,95	3	1,31	^(b)
Anilina	62-53-3	2,07	4	1,73	^(a)
3, 5-dinitrobenzamid	121-81-3	2,31	3	1,27	^(b)
Carbendazim	10605-21-7	2,35	3	1,37	^(c)
Triadimenol	55219-65-3	2,40	3	1,85	^(c)
Triazoxide	72459-58-6	2,44	3	1,66	^(c)
Triazophos	24017-47-8	2,55	3	1,78	^(c)
Linuron	330-55-2	2,59	3	1,97	^(c)
Naftalen	91-20-3	2,75	4	2,20	^(a)
Endosulfan-diol	2157-19-9	3,02	5	2,29	^(c)
Metiocarb	2032-65-7	3,10	4	2,39	^(c)
Barwnik Acid Yellow 21 9	63405-85-6	3,16	4	2,83	^(a)
1 , 2 , 3-trichlorobenzen	87-61-6	3,16	4	1,40	^(a)
Y-HCH	58-89-9	3,23	5	2,94	^(a)
Fention	55-38-9	3,31	3	2,49	^(c)
Barwnik Direct Red 81	2610-11-9	3,43	4	2,68	^(a)
Pyrazophos	13457-18-6	3,65	3	2,70	^(c)
a-endosulfan	959-98-8	4,09	5	3,74	^(c)
Diclofop metylowy	51338-27-3	4,20	3	3,77	^(c)
Fenantren	85-01-8	4,09	4	3,83	^(a)
Barwnik Basic Blue 41	26850-47-5	4,89	4	4,46	^(a)
(mieszany)	12270-13-2
ODT	50-29-3	5,63	1	-	^(b)
(a) W. Kördel. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoefftiienten organischern Chemikalien mit der HPLC. UBA R & D Report No 106 01 044 (1994). ^(b) B. V. Oepen. W. Kördel, W. Klein (1991). Chemosphere, 22, pp. 285-304. ^(c) Dane dostarczone przez przemysł.

C.20. BADANIE ROZRODCZOŚCI DAPHNIA MAGNA

1. METODA

Niniejsza metoda badania toksyczności dla rozrodczości jest kopią OECD TG 211 (1998).

1.1. WPROWADZENIE

Głównym celem badania jest ocena skutków działania substancji chemicznych na zdolność rozrodczości Daphnia magna.

1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI

Zwierzęta rodzicielskie: są tymi samicami Daphnia obecnymi na początku badania, których zdolność rozrodczości jest przedmiotem badań.

Potomstwo: są to młode Daphnia produkowane przez zwierzęta rodzicielskie w trakcie badania.

Najniższy obserwowany skutek stężenia (LOEC): jest to najmniejsze badane stężenie substancji badanej, przy którym obserwuje się statystycznie istotny skutek dotyczący rozrodczości i śmiertelności zwierząt macierzystych (przy p < 0,05) przy porównaniu z doświadczeniem kontrolnym, w ramach określonego czasu trwania ekspozycji na badania. Jednakże wszystkie badane stężenia powyżej LOEC muszą wykazywać szkodliwy skutek, równy lub większy niż ten obserwowany przy LOEC. Gdy te dwa warunki nie mogą być spełnione, muszą być podane wszystkie wyjaśnienia w odniesieniu do sposobu, w jaki LOEC (i stąd NOEC) zostało wybrane.

Nieobserwowany skutek stężenia (NOEC): jest stężeniem badanym bezpośrednio poniżej LOEC, które, gdy jest porównane z doświadczeniem kontrolnym, nie ma statystycznie istotnego skutku (p < 0,05), w ramach określonego czasu trwania ekspozycji na badanie.

EC_x: jest stężeniem substancji badanej rozpuszczonej w wodzie powodującym w x% redukcję w rozrodczości Daphnia magna w ramach okresu ekspozycji na badanie.

Wewnętrzny wskaźnik wzrostu: jest miarą wzrostu populacji, która łączy zdolność rozrodczą i określoną wiekowo śmiertelność (20) (21) (22). W populacji w stanie zrównoważonym jest równy zero. Dla rozwijających populacji będzie dodatni, a dla kurczących się populacji będzie ujemny. Jest oczywiste, że ten drugi jest niepodtrzymujący i ostatecznie prowadzi do zaniku.

Granica wykrywania: najniższe stężenie, które może być wykryte, ale nie można go ilościowo oznaczyć.

Granica oznaczania: najniższe stężenie, które można zmierzyć ilościowo.

Śmiertelność: zwierzę jest rejestrowane jako martwe, gdy jest nieruchome, tj. gdy nie jest w stanie pływać lub nie jest obserwowany ruch przydatków lub odwłoka, w ciągu 15 sekund po łagodnym poruszeniu zbiornika badanego. (Jeśli jest stosowana inna definicja, musi być to zrelacjonowane wraz z odniesieniem).

1.3. ZASADA METODY BADANIA

Młode samice Daphnia (zwierzęta rodzicielskie), w wieku poniżej 24 godzin na początku badania, są wystawiane na działanie substancji badanej dodanej do wody w zakresie stężeń. Czas trwania badania wynosi 21 dni. Na końcu badania szacowane jest całkowita ilość żyjącego potomstwa wyprodukowanego na zwierzę rodzicielskie, które przeżyło do końca badania. To oznacza, że młode wyprodukowane przez dorosłe zmarłe w czasie trwania badania są wykluczone z obliczeń. Zdolność rozrodcza zwierząt rodzicielskich może być wyrażona w inny sposób (np. liczba żyjącego potomstwa wyprodukowanego na zwierzę na dzień od pierwszego dnia zaobserwowania potomstwa), lecz powinno to być przedstawione jako dodatek do całkowitej liczby młodocianych wyprodukowanych na żywych rodziców na końcu badania. Zdolność rozrodcza zwierząt wystawianych na działanie substancji badanej jest porównywana do tej z doświadczenia kontrolnego w celu ustalenia najniższego obserwowanego skutku stężenia (LOEC), a stąd, nieobserwowanego skutku stężenia (NOEC). Ponadto w najszerszym możliwym zakresie dane analizuje się, stosując model regresji w celu prognozowania stężenia powodującego x% zmniejszenia zdolności rozrodczej (tj. EC₅₀, EC₂₀ lub EC₁₀).

Przeżycie zwierząt rodzicielskich i czas do produkcji potomstwa musi być również przedstawiony. Inne skutki związane z substancją dotyczące parametrów, takich jak rozwój (np. długość) i możliwy wewnętrzny wskaźnik wzrostu, może być również zbadane.

1.4. INFORMACJE DOTYCZĄCE SUBSTANCJI UŻYTEJ W BADANIU

Powinny być dostepne wyniki badania toksyczności ostrej (patrz metoda C.2, część I) wykonanej na Daphnia magna. Wyniki mogą być użyteczne przy wyborze właściwego zakresu stężeń badanych w badaniach rozrodczości. Rozpuszczalność w wodzie i ciśnienie pary substancji badanej powinny być znane, jak również powinna być dostępna niezawodna metoda określania ilościowego substancji w roztworach badanych o udokumentowanej wydajności i granicy określenia.

Informacje dotyczące substancji badanej, które mogą być użyteczne w ustalaniu warunków badania, obejmują: wzór strukturalny, czystość substancji, stabilność w świetle, stabilność w warunkach badania, pKa, P_ow i wyniki badania szybkiej biodegradacji (patrz metoda C.4).

1.5. WAŻNOŚĆ BADANIA

Aby badanie było ważne, powinny być spełnione następujące kryteria wykonania doświadczeń kontrolnych:

- śmiertelność zwierząt rodzicielskich (samice Daphnia) nie przewyższa 20% na koniec badania,

- średnia liczba żyjącego potomstwa wyprodukowanego na zwierzę rodzicielskie przeżywające na koniec badania wynosi ≥ 60.

1.6. OPIS METODY BADANIA

1.6.1. Aparatura

Zbiorniki do badań i inna aparatura, która wchodzi w kontakt z roztworami badanymi, powinny być wykonane całkowicie ze szkła lub innego chemicznie obojętnego materiału. Zbiornikami do badań będą zwykłe szklane zlewki.

Ponadto wymagane są wszystkie lub kilka z następujących sprzętów:

- miernik tlenu (z mikroelektrodą lub innym odpowiednim wyposażeniem do pomiaru rozpuszczonego tlenu w próbkach o małej objętości),

- odpowiedni aparat do kontroli temperatury,

- pehametr,

- wyposażenie do określenia twardości wody,

- sprzęt do określenia całkowitego węgla organicznego (TOC) w wodzie lub wyposażenie do określenia zapotrzebowania na chemiczny tlen (COD),

- odpowiednia aparatura do kontroli parametrów światła i pomiaru intensywności oświetlenia.

1.6.2. Organizmy użyte w badaniu

Gatunkiem wykorzystywanym w badaniu jest Daphnia magna Straus. Inne gatunki Daphnia wykorzystuje się, zapewniając, że odpowiadają właściwym kryteriom ważności (kryterium ważności dotyczące zdolności rozrodczej przy doświadczeniach kontrolnych powinny być właściwe w odniesieniu do gatunku Daphnia). Jeśli wykorzystane są inne gatunki Daphnia, muszą być one wyraźnie określone, a ich wykorzystanie musi być uzasadnione.

Najlepiej, aby klon był określony za pomocą genotypowania. Badania (1) wykazały, że zdolności reprodukcyjne klonu A (pochodzącego z IRCHA we Francji) (3) konsekwentnie odpowiadają kryterium ważności średniej ≥ 60 potomstwa na rodzicielskie zwierzę przeżywające, gdy jest hodowane zgodnie z warunkami opisanymi w niniejszej metodzie. Jednakże inne klony są akceptowalne, pod warunkiem że wykazano że kultura Daphnia spełnia kryteria ważności dotyczące badania.

Na początku badania zwierzęta powinny być młodsze niż 24 godziny i nie muszą być pierwszym potomstwem. Powinny one pochodzić ze zdrowej hodowli (tj. niewykazujące takich oznak stresu, jak wysoka śmiertelność, obecności samców i ephippia, opóźnień w produkcji pierwszego potomstwa, zwierząt odbarwionych itd.). Podstawowe zwierzęta muszą być utrzymywane w warunkach właściwych dla ich hodowli (światło, temperatura, ośrodek, karmienie i ilość zwierząt na jednostkę objętości), zbliżonych do tych stosowanych w badaniu. Jeśli ośrodek hodowli Daphnia używany w badaniu różni się od rutynowego dla hodowli Daphnia, jest dobrą praktyką włączyć okres aklimatyzacji przed badaniem, zwykle około trzech tygodni (tj. jedno pokolenie), aby zapobiec stresowi zwierząt rodzicielskich.

1.6.3. Ośrodek badania

Jest zalecane, aby w badaniu użyć w pełni określony ośrodek. Umożliwia to zapobieżenie użyciu dodatków (np. wodorostów, ekstraktu ziemi i tak dalej), które trudno scharakteryzować, a w ten sposób poprawić możliwości standaryzacji między laboratoriami. Ośrodki Elendt M4 (4) i M7 (patrz dodatek 1) uznano za właściwe do tego celu. Są też akceptowane inne ośrodki odpowiednie w tym celu (np. (5) (6)), które dostarczają zdolności dla hodowli Daphnia spełnienia kryteriów ważności dotyczących badania.

Jeśli stosowane ośrodki zawierają niezdefiniowane dodatki, powinny być one wyraźnie określone, a informacja o nich powinna być zawarta w sprawozdaniu z badań dotyczącym ich składu, w szczególności w odniesieniu do zawartości węgla organicznego, mogącą wpływać na dostarczaną dietę. Jest zalecane, aby zawartość całkowitego węgla organicznego (TOC) i/lub zapotrzebowanie na tlen chemiczny (COD) w podstawowych preparatach dodatków organicznych były oznaczone i by oszacowano końcowy udział TOC/COD w ośrodku badanym. Zalecane jest, aby poziomy TOC w ośrodku (tj. przed dodaniem alg) były poniżej 2 mg/l (7).

W przypadku substancji badanych zawierających metale istotne jest, aby uwzględniać, że właściwości ośrodka (np. twardość, zdolność chelatująca) mogą wpływać na toksyczność badanej substancji. Z tej przyczyny jest pożądany w pełni zdefiniowany ośrodek. Jednakże obecnie jedynymi w pełni zdefiniowanymi ośrodkami uznanymi za odpowiednie dla hodowli długoterminowej Daphnia magna są Elendt M4 i M7. Oba ośrodki zawierają związek chelatujący EDTA. Prace wykazały (2), że "oczywista toksyczność" kadmu jest ogólnie niższa, gdy badanie rozrodczości jest prowadzone w ośrodkach M4 i M7 niż w ośrodkach niezawierających EDTA. M4 i M7 dlatego nie są zalecane do badań substancji zawierających metale, a inne ośrodki zawierające znane środki chelatujące powinny być również unikane. W odniesieniu do substancji zawierających metale może być wskazane użycie alternatywnego ośrodka, takiego jak na przykład odtworzona świeża twarda woda ASTM (7), która nie zawiera EDTA, z dodatkiem ekstraktu wodorostów (8). Ta kombinacja odtworzonej świeżej twardej wody ASTM i ekstraktu wodorostów jest także odpowiednia dla długoterminowej hodowli oraz badania Daphnia magna (2), chociaż obserwuje się łagodne działanie chelatujące z powodu składnika organicznego w dodanym ekstrakcie wodorostu.

Na początku i w trakcie trwania badania stężenie rozpuszczonego tlenu powinno być powyżej 3 mg/l. Wartość pH powinna być w zakresie 6-9 i zwykle nie powinna różnić się o więcej niż 1,5 jednostki w każym pojedynczym badaniu. Twardość powyżej 140 mg/l (jako CaCO₃) jest zalecana. Badania na tym poziomie i powyżej wykazały zdolność rozrodczą w zgodności z kryteriami ważności (9) (10).

1.6.4. Roztwory użyte w badaniu

Roztwory użyte o wybranych stężeniach są zwykle przygotowywane przez rozcieńczenie roztworu podstawowego. Zalecane jest przygotowanie roztworów podstawowych przez rozpuszczenie substancji badanej w ośrodku badanym.

W niektórych przypadkach stosowanie rozpuszczalników organicznych lub dyspergatorów może być wymagane w celu uzyskania odpowiednio stężonego roztworu podstawowego, ale należy dołożyć wszelkich starań, aby zapobiec użyciu takich materiałów. Przykładami odpowiednich rozpuszczalników są aceton, etanol, metanol, dwumetyloformamid i glikol trójetylenowy. Przykładami odpowiednich dyspergatorów są Cremophor RH40, metyloceluloza 0,01% i HCO-40. W każdym przypadku substancja badana w roztworach badanych nie powinna przekraczać granicy rozpuszczalności w ośrodku badanym.

Rozpuszczalniki są stosowane do wykonania roztworu podstawowego, który może być dozowany ściśle do wody. W zalecanym stężeniu rozpuszczalnika w końcowym ośrodku badanym (tj. ≤ 0,1 ml/l) rozpuszczalniki wymienione powyżej nie będą toksyczne i nie mogą podnosić rozpuszczalności substancji w wodzie.

Dyspergatory mogą pomagać w dokładnej dawce i rozproszeniu. Przy zalecanym stężeniu w końcowym ośrodku badanym (≤ 0,1 ml/l) dyspergatory wymienione powyżej nie będą toksyczne i nie będą podnosić rozpuszczalności substancji w wodzie.

1.7. PROJEKT BADANIA

Traktowanie powinno być rozdzielone do zbiorników do badań, a wszystkie następujące czynności ze zbiornikami do badań powinny być prowadzone metodą losową. Niezastosowanie się do tego może powodować powstanie błędów systematycznych, które mogą być zinterpretowane jako wpływ stężenia. W szczególności jeśli jednostki doświadczalne są obsługiwane według traktowania lub stężenia, wtedy niektóre związane z czasem skutki, takie jak zmęczenie operatora lub inny błąd mogą prowadzić do poważniejszych skutków przy wyższych stężeniach. Ponadto, jeśli na wyniki badania prawdopodobnie wpłyną początkowe lub środowiskowe warunki, takie jak położenie w laboratorium, należy rozważyć wykonanie badania blokowego.

1.8. PROCEDURA

1.8.1. Warunki ekspozycji

1.8.1.1. Czas trwania

Czas trwania badania wynosi 21 dni.

1.8.1.2. Załadunek

Zwierzęta rodzicielskie są utrzymywane pojedynczo, jedno na zbiornik do badań, z 50-100 ml ośrodka w każdym zbiorniku.

Większe objetości czasem są niezbędne do spełnienia wymagań procedury analitycznej stosowanej do określania stężenia substancji badanej, chociaż zakładanie kopii w odniesieniu do analizy chemicznej jest też dopuszczalne. Jeśli stosuje się objetości większe niż 100 ml, racje podawane Daphnia mogą wymagać zwiększenia w celu zapewnienia odpowiedniej dostępności pożywienia i zgodności z kryteriami ważności. W odniesieniu do badań przepływowych, alternatywne projekty mogą być rozważane z przyczyn technicznych (np. cztery grupy po 10 zwierząt w większej objętości badanej), lecz wszystkie zmiany projektu badania powinny być przedstawione.

1.8.1.3. Liczba zwierząt

W odniesieniu do półstatycznych badań co najmniej 10 zwierząt jest trzymanych pojedynczo przy każdym stężeniu badanym i co najmniej 10 zwierząt trzymanych pojedynczo w seriach kontrolnych.

W odniesieniu do badań przepływowych 40 zwierząt, podzielonych na grupy po 10 zwierząt w każdym stężeniu badanym, okazało się być odpowiednie (1). Mniejsza liczba organizmów badanych może być wykorzystana, a minimum 20 zwierząt na stężenie, podzielonych w dwie lub więcej kopii z równą ilością zwierząt (np. cztery kopie każda z pięcioma daphnid). Należy zauważyć, że w odniesieniu do badań, w których zwierzęta są trzymane w grupach, nie jest możliwe wyrażenie zdolności rozrodczej jako całkowitej liczby żyjącego potomstwa wyprodukowanego na rodzicielskie zwierzę, które żyje na końcu badania, jeśli zwierzęta rodzicielskie zmarły. W tych przypadkach zdolność rozrodcza powinna być wyrażona jako "całkowita liczba żyjącego potomstwa wyprodukowanego na rodzica obecnego na początku badania".

1.8.1.4. Karmienie

W odniesieniu do badań półstatycznych karmienie powinno być wykonywane najlepiej codziennie, lecz przynajmniej trzy razy na tydzień (tj. zgodnie z wymianami ośrodka). Odchylenia od tego (np. w odniesieniu do badań przepływowych, powinno być przedstawione.

W czasie trwania badania dieta zwierząt rodzicielskich powinno składać się z żyjących komórek glonowych jednego lub więcej z nastepujących typów: Chlorella sp., Selenastrum capricornutum (obecnie Pseudokirchneriella subcapitata (11)) i Scenedesmus subspicatus. Dostarczana dieta powinna być oparta na ilości węgla organicznego dostarczanego każdemu zwierzęciu rodzicielskiemu. Badania (12) wykazały, że dla Daphnia magna poziomy racji między 0,1 i 0,2 mg C/Daphnia/dzień są wystarczające do uzyskania odpowiedniej liczby potomstwa spełniajacego kryteria ważności. Racje dostarczane są jako stały wskaźnik poprzez czas badania albo, jeśli to jest pożądane, stosując niski wskaźnik na początku i zwiększany w czasie trwania badania, uwzględniając rozwój zwierząt rodzicielskich. W tym przypadku racje powinny nadal pozostawać w granicach zalecanego zakresu 0,1-0,2 mg C/Daphnia/dzień przez cały czas.

Jeśli mają być stosowane środki zastępcze, takie jak ilość komórek glonowych lub absorpcja światła, do karmienia na wymaganym poziomie racji (tj. dla wygody, ponieważ pomiar zawartości węgla zabiera czas) każde laboratorium musi wykonać swój własny nomogram odnoszący się do zależności środka zastepczego oraz zawartości węgla hodowli glonów (patrz dodatek 2 dotyczący zaleceń odnoszących się do wykonania nomogramu). Nomogramy powinny być sprawdzane co najmniej corocznie i częściej, gdy warunki hodowli glonów uległy zmianie. Odkryto, że absorpcja światła jest lepszą namiastką dla zawartości węgla niż ilość komórek (13).

W celu zminimalizowania objętości kultur glonów dostarczanych do ośrodka zbiorników do badań Daphnia powinny być karmione koncentratem glonów w nośniku. Stężenie glonów może być uzyskane przez odwirowanie zawiesiny w destylowanej albo dejonizowanej wodzie z pierwotnej zawiesiny lub z ośrodka kultur Daphnia.

1.8.1.5. Światło

16 godzin światła przy intensywności nie przekraczajacej 15-20 μE * m^-2 * s^-1.

1.8.1.6. Temperatura

Temperatura ośrodka badanego powinna być w zakresie 18-22° C. Jednakże w odniesieniu do jednego badania nie może, jeśli to możliwie, różnić się o więcej niż 2° C w ramach tych granic (np. 18-20, 19-21 lub 20-22° C). Właściwe może być użycie dodatkowego zbiornika badanego do celów monitorowania temperatury.

1.8.1.7. Napowietrzanie

W czasie trwania badania zbiorniki do badań nie mogą być napowietrzane.

1.8.2. Stężenie użyte w badaniu

Zwykle powinno być co najmniej pięć stężeń ułożonych w serii geometrycznej ze wskaźnikiem odstępu najlepiej nie przekraczającym 3,2 oraz właściwej liczbie kopii dla każdego stężenia badanego (patrz ppkt 1.8.1.3). Powinno być przedstawione uzasadnienie w przypadku zastosowania mniej niż pięciu stężeń. Nie powinny być badane substancje powyżej ich granicy rozpuszczalności w ośrodku badanym.

W określaniu zakresu stężeń należy uwzględnić, co następuje:

(i) jeśli celem jest uzyskanie LOEC/NOEC, najniższe stężenie badane musi być wystarczająco niskie, aby płodność przy tym stężeniu nie była znacząco niższa niż w doświadczeniu kontrolnym. W innym przypadku badanie będzie musiało być powtórzone ze zmniejszonym najniższym stężeniem;

(ii) jeśli celem jest uzyskanie LOEC/NOEC, najwyższe stężenie badane musi być wystarczająco wysokie, aby płodność przy tym stężeniu była znacząco niższa niż w doświadczeniu kontrolnym. W innym przypadku badanie będzie musiało być powtórzone ze zwiększonym najwyższym stężeniem;

(iii) jeśli szacowane jest EC_X odnoszące się do skutków dotyczących rozrodczości, wskazane jest użycie wystarczającego stężenia w celu określenia EC_X z właściwym poziomem wiarygodności. Jeśli szacowany jest EC₅₀ odnoszący się do skutków dotyczących rozrodczości, wskazane jest, aby najwyższe stężenie badane było wyższe niż ten EC₅₀. Inaczej, choć będzie jeszcze możliwe oszacowanie EC₅₀, przedział ufności dla EC₅₀ będzie bardzo szeroki i nie będzie możliwe zadawalające ocenienie odpowiedniości dopasowanego modelu;

(iv) zakres stężeń badanych nie powinien obejmować żadnych stężeń, które mają statystycznie znaczący wpływ na przeżycie dorosłych, ponieważ powoduje to zmianę charakteru badania z badania prostej rozrodczości na badanie złożonej rozrodczości i śmiertelności, wymagający bardziej złożonej analizy statystycznej.

Uprzednia wiedza dotycząca toksyczności substancji badanej (np. z badania ostrego i/lub badań szukania zakresu) powinna być pomocna w wyborze właściwych stężeń badanych.

W przypadku gdy rozpuszczalnik lub dyspergator stosowano do pomocy w przygotowaniu roztworów badanych (patrz ppkt 1.6.4), ich końcowe stężenie w zbiornikach do badań nie powinno przekraczać 0,1 ml/l oraz powinno być takie samo we wszystkich zbiornikach do badań.

1.8.3. Doświadczenia kontrolne

Do serii badanej dodatkowo musi być włączona jedna seria kontrolna badanego ośrodka oraz, jeżeli to właściwe, jedna seria kontrolna zwierająca rozpuszczalnik lub dyspergator. Gdy stosowany jest rozpuszczalnik lub dyspergator, ich stężenie powinno być takie samo jak używane w zbiornikach zawierających substancję badaną. Należy użyć właściwą ilość kopii (patrz ppkt 1.8.1.3).

Ogólnie w dobrze przebiegającym badaniu współczynnik zmian wokół średniej ilości żyjącego potomstwa produkowanego urodzonego na jedno rodzicielskie zwierzę w doświadczeniu(-ach) kontrolnym(-ych) powinna wynosić ≤ 25% oraz powinno to być przedstawione w odniesieniu do projektów badania stosującego pojedynczo trzymane zwierzęta.

1.8.4. Odnawianie ośrodka użytego w badaniu

Częstotliwość odnawiania ośrodka zależy od stabilności substancji badanej, lecz powinna następować co najmniej trzy razy na tydzień. Jeśli z wstępnego badania stabilności (patrz ppkt 1.4) wynika, że stężenie substancji badanej nie jest stabilne (tj. poza zakresem 80-120% nominalnego lub spada poniżej 80% mierzonego stężenia początkowego) poza maksymalnym okresem odnawiania (tj. trzy dni), należy rozważyć częstszą wymianę ośrodka lub zastosowania badania przepływowego.

Gdy ośrodek jest wymieniany w badaniach półstatycznych, przygotowuje się drugą serię zbiorników do badań, a zwierzęta rodzicielskie są do nich przenoszone, na przykład szklaną pipetą o odpowiedniej średnicy. Objętość ośrodka przenoszonego z Daphnia powinna być zminimalizowana.

1.8.5. Obserwacje

Wyniki obserwacji dokonanych w trakcie trwania badania powinny być odnotowane w arkuszach danych (patrz przykłady w dodatkach 3 i 4). Jeśli inne pomiary są wymagane (patrz ppkt 1.3 i 1.8.8), dodatkowe obserwacje mogą być wymagane.

1.8.6. Potomstwo

Potomstwo wyprodukowane prze każde zwierzę rodzicielskie powinno być usunięte i policzone codziennie od pojawienia sie pierwszego potomstwa w celu powstrzymania ich przed zjedzeniem pokarmu przeznaczonego dla dorosłych. Do celów niniejszej metody potrzebne jest tylko liczenie ilości żyjącego potomstwa, lecz obecność przerwanych jaj lub martwego potomstwa powinna być także odnotowana.

1.8.7. Śmiertelność

Śmiertelność zwierząt rodzicielskich powinna być rejestrowana najlepiej codziennie co najmniej w tych samych porach, gdy liczone jest potomstwo.

1.8.8. Inne parametry

Chociaż niniejsza metoda jest przeznaczona zasadniczo do oceny skutków dotyczących rozrodczości, możliwe jest, że inne efekty zostaną wystarczająco określone, aby umożliwić ich statystyczną analizę. Wysoce pożądane są pomiary rozwoju, ponieważ dostarczają one informacji dotyczących możliwych skutków podśmiertelnych, które mogą być bardziej użyteczne niż tylko sam pomiar rozrodczości; pomiar długości zwierząt rodzicielskich (tj. długość ciała, wyłączając kolec odbytowy) jest zalecany na końcu badania. Inne parametry do zmierzenia lub obliczenia obejmują: czas do produkcji pierwszego potomstwa (i dalszego potomstwa), liczbę i rozmiary potomstwa na zwierzę, liczbę poronień, obecność samic lub ephippię oraz wewnętrzny wskaźnik przyrostu populacji.

1.8.9. Częstotliwość analitycznych określeń i pomiarów

Stężenie tlenu, temperatura, wartości twardości i pH powinny być mierzone co najmniej raz tygodniowo, w świeżych i starych roztworach, w kontrolnych i w najwyższych stężeniach badanej substancji.

W czasie trwania badania stężenia substancji użytej w badaniu są określane w regularnych odstępach czasu.

W półstatycznych badaniach, w przypadku gdy oczekuje się, że stężenie substancji pozostanie w zakresie ± 20% nominału (tj. w zakresie 80-120% - patrz ppkt 1.4 i 1.8.4), jest zalecane, aby jako minimum analizować najniższe i najwyższe stężenia użyte w badaniu świeżo po przygotowaniu i zaraz przed odnowieniem, po jednym w czasie trwania pierwszego tygodnia badania (tj. analizy powinny być dokonane na próbce z tego samego roztworu - gdy świeżo przygotowany i przy odnowieniu). Te określenia powinny być powtarzane przynajmniej w odstępach tygodniowych, w późniejszym czasie.

W odniesieniu do badań, w których nie oczekuje się, że stężenie substancji użytej w badaniu pozostanie w zakresie ± 20% nominału, konieczne jest analizowanie wszystkich stężeń po świeżym przygotowaniu i przy odnowieniu. Jednakże w odniesieniu do tych badań, w których zmierzone początkowe stężenie nie jest w zakresie ± 20% nominału, lecz gdy mogą być dostarczone wystarczające dowody wskazujące, że wstepne stężenia są powtarzalne i stabilne (tj. w zakresie 80-120% stężenia początkowego), oznaczenia chemiczne mogą być zmniejszone w tygodniu 2 i 3 badania do najwyższego i najniższego stężenia badanego. We wszystkich przypadkach oznaczenie stężenia substancji użytej w badaniu przed odnowieniem wymaga jedynie prowadzenia na jednym kopiowanym zbiorniku dla każdego stężenia badanego.

W odniesieniu do badań przepływowych właściwe jest użycie podobnego do opisanego dla badań półstatycznych sposobu pobierania próbek (lecz pomiar "starych" roztworów nie jest stosowany w tym przypadku). Jednakże wskazane jest zwiększenie ilości pobieranych próbek podczas pierwszego tygodnia (np. trzy zestawy pomiarów) w celu zapewnienia, aby stężenia badane pozostały stałe. W tego typu badaniach jednostka przepływu rozcieńczalnika i substancji badanej powinny być sprawdzane codziennie.

Jeśli istnieją dowody, że stężenie substancji badanej jest zadawalająco utrzymywane w granicach ± 20% nominalnego lub zmierzonego początkowego stężenia poprzez badanie, wtedy wyniki oparte są o nominalnych lub zmierzonych początkowych wartościach. Jeśli odchylenie od nominalnego lub zmierzonego stężenia jest większe niż ± 20%, wyniki muszą być wyrażone w średniej ważonej czasu (patrz dodatek 5).

2. DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ

2.1. OPRACOWANIE WYNIKÓW

Celem niniejszego badania jest ustalenie działania substancji użytej w badaniu na całkowitą liczbę żywego potomstwa wyprodukowanego na zwierzę rodzicielskie, żyjące na koniec badania. Całkowita liczba potomstwa na zwierzę rodzicielskie powinna być obliczona w odniesieniu do każdego badanego zbiornika (tj. kopii). Jeśli w jakimś skopiowanym zbiorniku zwierzę rodzicielskie zmarło w czasie trwania badania lub okazało się samcem, to ta kopia jest wyłączona z analizy. Analiza jest wtedy oparta na zmniejszonej ilości kopii.

W odniesieniu do oszacowania LOEC, a stąd NOEC, w odniesieniu do skutków substancji chemicznych dotyczących zdolności rozrodczej, konieczne jest obliczenie średniej zdolności rozrodczej poprzez kopie dla każdego stężenia i złożonego pozostałego stadardowego odchylenia poprzez użycie analizy wariancji (ANOVA). Średnia w odniesieniu do każdego stężenia musi być porównana ze średnią doświadczenia kontrolnego, stosując właściwą metodę wielokrotnego porównania. Użyteczne są badania Dunnetta lub Williamsa (14) (15) (16) (17). Koniecznie należy sprawdzić, czy założenie metody ANOVA homogeniczności odchylenia jest utrzymane. Jest zalecane, aby zostało to wykonane w sposób graficzny niż poprzez formalnie znaczące badanie (18); odpowiednią alternatywą jest przeprowadzenie badania Bartletta. Jeśli to założenie nie jest utrzymane, należy rozważyć przekształcenie danych do shomogenizowania wariancji, przed przeprowadzeniem ANOVA albo przeprowadzić ważoną ANOVA. Zakres skutków wykrywalnych przy zastosowaniu ANOVA (tj. najmniej znaczącej różnicy) powinien być obliczony i odnotowany.

Dla oszacowania stężenia, które spowoduje 50% zmniejszenia zdolności rozrodczej (tj. EC₅₀), odpowiednia krzywa, taka jak krzywa logistyczna, powinna być dopasowana do danych, używając metody statystycznej, takiej jak najmniejszych kwadratów. Krzywa musi być sparametryzowana, tak aby EC₅₀ i jej błąd standardowy można było obliczyć bezpośrednio. Ułatwiałoby to obliczenie granic ufności w zakresie EC₅₀. O ile istnieją słuszne przyczyny, aby preferować różne poziomy ufności, dwustronne 95-procentowe granice ufności powinny być podawane. Procedura spasowania powinna zasadniczo dostarczać środki oceny znaczenia braku spasowania. Może to być wykonane graficznie lub przez podzielenie pozostałej sumy kwadratów na "brak pasowania" i "czyste składniki błędu", a przeprowadzenie badania istotności w odniesieniu do braku spasowania. Ponieważ obróbka dająca wysoką płodność prawdopodobnie zapewni większe odchylenie w ilości młodych osobników wyprodukowanych niż obróbka dająca niską płodność, muszą być podjęte rozważania do zważenia obserwowanych wartości dla odzwierciedlenia różnych wariancji w różnych opracowywanych grupach (patrz podstawowe informacje w bibliografii (18)).

W analizie danych z końcowego badania obrączkowego (2) spasowano krzywą logistyczną, posługując się następujacym modelem, chociaż inny odpowiedni model może być użyty:

_grafika

Niniejszy model jest prawdopodobnie odpowiedni w dużej ilości sytuacji, ale są badania, dla których nie jest właściwy. Ważność powyższego sugerowanego modelu powinna zostać sprawdzona. W niektórych przypadkach model hormesis, w którym niskie stężenia powodują lepsze wyniki, może być właściwy (19).

Inne skutki stężeń, takie jak EC₁₀lub EC₂₀, mogą również być oszacowane, chociaż bardziej pożądane jest użycie różnej parametryzacji modelu, z którego oszacowano EC₅₀.

2.2. SPRAWOZDANIE Z BADANIA

Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące dane:

2.2.1. Substancja użyta w badaniu:

- charakter fizyczny i stosowne właściwości fizykochemiczne,

- dane identyfikacji chemicznej, włączając czystość.

2.2.2. Gatunki użyte w badaniu:

- klon (czy był typowany genetycznie), dostawca lub źródło (jesli jest znane) i warunki stosowanej hodowli. Jeśli użyto innego gatunku niż Daphnia powinno to być przedstawione i uzasadnione.

2.2.3. Warunki badania:

- stosowana procedura badania (np. półstatyczna lub przepływowa, objętość, obciążenie w ilości Daphnia na litr),

- czas trwania naświetlania i intensywność światła,

- projekt badania (np. ilość kopii, ilość rodziców na kopię),

- szczegółowe informacje dotyczące kultur stosowanego ośrodka,

- jeśli stosowano, dodatki materiałów organicznych, włączając ich skład, źródło, metodę przygotowania, TOC/COD preparatów podstawowych, oszacowanie wynikłego TOC/COD w ośrodku badanym,

- szczegółowe informacje o karmieniu, włączając ilość (w mg C/Daphnia/dzień) i plan (np. typ karmy, włączając dla glonów właściwą nazwę, gatunek i, jeśli znany szczep, warunki kultur),

- metoda przygotowania roztworów podstawowych i częstotliwość odnawiania (muszą być podane stężenia rozpuszczalników i dyspergantów, jeśli je użyto).

2.2.4. Wyniki:

- wyniki ze wszystkich wstępnych badań dotyczące stabilności substancji badanej,

- nominalne stężenia badane i wyniki wszystkich analiz ustalających stężenia substancji badanej w zbiornikach do badań (patrz przykładowy arkusz danych w dodatku 4); zdolność wyjściowa metody i granice oznaczania powinny być również przedstawione,

- jakość wody w zbiornikach do badań (tj. pH, temperatura, stężenie rozpuszczonego tlenu, TOC i/lub COD oraz twardość tam, gdzie to ma zastosowanie) (patrz przykładowy arkusz danych w dodatku 3),

- pełny zapis żyjącego potomstwa każdego zwierzęcia rodzicielskiego (patrz przykładowy arkusz danych w dodatku 3),

- ilość zgonów między zwierzętami rodzicielskimi i data, kiedy nastąpiły (patrz przykładowy arkusz danych w dodatku 3),

- współczynnik rozrzutu dla kontroli płodności (oparty na całkowitej ilości żyjącego potomstwa na ilość żywych pod koniec badania zwierząt rodzicielskich),

- wykres całkowitej liczby żyjącego potomstwa na zwierzę rodzicielskie (w odniesieniu do każdej kopii) żyjące na koniec badania w zależności od stężenia substancji badanej,

- najniższy obserwowany skutek stężenia (LOEC) dla rozrodczości, włączając opis zastosowanych procedur statystycznych i wskazanie zakresu skutków, jaki jest wykrywany, oraz nieobserwowany skutek stężenia (NOEC) dla rozrodczości; gdzie stosowne, należy także przedstawić LOEC/NOEC w odniesieniu do śmiertelności zwierząt rodzicielskich,

- tam gdzie to jest stosowne, EC_x w odniesieniu do rozrodczości i przedziałów zaufania oraz wykres dopasowanego modelu użytego do obliczeń, nachylenie krzywej dawka-reakcja i jej błąd standardowy,

- inne obserwowane skutki biologiczne lub pomiary: przedstawienie wszystkich innych biologicznych skutków zaobserwowanych lub pomierzonych (np. rozwój zwierząt rodzicielskich), włączając właściwe uzasadnienie,

- wytłumaczenie wszystkich odchyleń od metody badania.

3. BIBLIOGRAFIA

(1) OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on the Daphnia magna Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 20-21 March 1993.

(2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 6. Report of the Final Ring Test of the Daphnia magna Reproduction Test Paris. 1997.

(3) Baird D. J., Barber J., Bradley M. C., Soares A. M. V. M. and Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia magna Strauss. Ecotoxicology and Environmental Safety, 21, pp. 257-265.

(4) Elendt B. P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, pp. 25-33.

(5) EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio.

(6) Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring waters as standard medium for culturing Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 47, pp. 775-782.

(7) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729-88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia P. A. 20 pp.

(8) Baird D. J., Soares A. M. V. M., Girling A., Barber J., Bradley M. C. and Calow P. (1989). The long term maintenance of Daphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests; problems and prospects. In: Proceedings of the 1st European Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H. Løkke, H. Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.), pp. 144-148.

(9) Parkhurst B. R., Forte J. L. and Wright G. P. (1981). Reproducibility of a life-cycle toxicity test with Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 26, pp. 1-8.

(10) Cowgill U. M. and Milazzo D. P. (1990) The sensitivity of two cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), pp. 185-196.

(11) Korshikov (1990). Pseudokirchneriella subcapitata Hindak, F-1990. Biologice Prace, 36, 209.

(12) Sims I. R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward a standard Daphnia juvenile production test. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, pp. 2053-2058.

(13) Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the relationship between total organic carbon with three commonly used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, pp. 459-466.

(14) Dunnett C. W., (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, pp. 1096-1121.

(15) Dunnett C. W., (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, pp. 482-491.

(16) Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, pp. 103-117.

(17) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28, pp. 510-531.

(18) Draper N. R. and Smith H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition, Wiley, N. Y.

(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, pp. 93-96.

(20) Wilson E. O. and Bossert W. H. (1971). A Primer of Population Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.

(21) Poole R. W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. McGraw-Hill Series in Population Biology, New York, pp. 532.

(22) Meyer J. S., Ingersoll C. G., McDonald L. L. and Boyce M. S. (1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, pp. 1156-1166.

DODATEK 1

PRZYGOTOWANIE W PEŁNI ZDEFINIOWANYCH OŚRODKÓW ELENDT M7 I M4

Aklimatyzacja do ośrodków Elendt M7 i M4

Niektóre laboratoria doświadczyły trudności w bezpośrednim przeniesieniu Daphnia do ośrodków M4 (1) i M7. Jednakże pewien sukces został osiągnięty ze stopniową aklimatyzacją, tj. zastepując własny ośrodek najpierw 30% Elendt, nastepnie do 60% Elendt, a nastepnie do 100% Elendt. Okresy czasu potrzebne do aklimatyzacji mogą trwać do jednego miesiąca.

PRZYGOTOWANIE

Mikroelementy

Odrębne roztwory podstawowe (I) poszczególnych mikroelementów są uprzednio przygotowywane w wodzie o odpowiedniej czystości, np. dejonizowanej destylowanej lub odwrócona osmoza. Z tych różnych roztworów podstawowych (I) jest przygotowywany drugi pojedynczy roztwór podstawowy (II), który zawiera wszystkie mikroelementy (połączony roztwór), np.:

Roztwór podstawowy I (pojedyncze substancje)	Ilość dodana do wody (mg/1)	Stężenie (w stosunku do ośrodka M4) (krotność)	Do przygotowania połączonego roztworu podstawowego II dodać następującą lość roztworu podstawowego i do wody (ml/l)
Roztwór podstawowy I (pojedyncze substancje)	Ilość dodana do wody (mg/1)	Stężenie (w stosunku do ośrodka M4) (krotność)	M4	M7
H₃BO₃	57 190	20 000	1,0	0,25
MnCl₂*4 H₂O	7 210	20 000	1,0	0,25
LiCl	6 120	20 000	1,0	0,25
RbCl	1 420	20 000	1,0	0,25
SrCl₂ * 6 H₂O	3 040	20 000	1,0	0,25
NaBr	320	20 000	1,0	0,25
Na₂MoO₄ * 2 H₂O	1 260	20 000	1,0	0,25
CuO₂ * 2 H₂O	335	20 000	1.0	0,25
ZnCl2	260	20 000	1,0	1,0
CoCl₂ * 6 H₂O	200	20 000	1,0	1,0
KI	65	20 000	1,0	1,0
Na₂SeO₃	43,8	20 000	1,0	1,0
NH₄VO₃	11,5	20 000	1,0	1,0
Na₂EDTA * 2 H₂O	5 000	2000	-	-
FeSO₄ * 7 H₂O	1 991	2000	-	-
Oba roztwory Na₂EDTA i FeSO₂ przygotowano oddzielnie, zlane razem i niezwłocznie autoklawowane. To daje:
21 Fe-EDTA roztwór		1 000	20,0	5,0

Ośrodki M4 i M7

Ośrodki M4 i M7 są przygotowane przy użyciu roztworu podstawowego II makro-substancje odżywcze i witaminy, jak następuje:

	Ilość dodana do wody (mg/l)	Stężenie (w stosunku do ośrodka M4) (krotność)	Ilość roztworu podstawowego do przygotowania ośrodka (mg/l)
	Ilość dodana do wody (mg/l)	Stężenie (w stosunku do ośrodka M4) (krotność)	M4	M7
Roztwór podstawowy II, połączone mikroelementy		20	50	50
Makroodżywcze roztwory podstawowe (pojedyncze substancje):
CaCl₂ * 2 H₂O	293 800	1000	1,0	1,0
MgSO₄ * 7 H₂O	246 600	2000	0,5	0,5
KCl	58 000	10 000	0,1	0,1
NaHCO₃	64 800	1000	1,0	1,0
Na₂SiO, * 9 H₂O	50 000	5000	0,2	0,2
NaNO₃	2740	10 000	0,1	0,1
KH₂PO₄	1 430	10 000	0.1	0,1
K₂HPO₄	1 840	10 000	0,1	0,1
Roztwór związany witamin	-	10 000	0,1	0,1
Podstawowy roztwór związany witamin przygotowano poprzez dodanie 3 witamin do 1 litra wody jak wskazano poniżej:
Hydrochlorek tiaminy	750	10 000	-	-
Cyjanocobalamina (B₁₂)	10	10 000	-	-
Biotyna	7,5	10 000	-	-
Uwagi: Aby zapobiec wytrącaniu się soli przy przygotowaniu kompletnego ośrodka, dodać podwielokrotność roztworów podstawowych do około 500-800 ml dejonizowanej wody a następnie dopełnić do litra. Pierwszą publikacje o ośrodku M4 moża znaleźć w: B. P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia manga Straus. Protoplasma, 154, pp. 25-33. Wsad połączonych witamin jest przechowywany w zamrożeniu w małych podwielokrotnościach. Witaminy są dodawane do ośrodka krótko przed użyciem.

DODATEK 2

ANALIZA CAŁKOWITEGO WĘGLA ORGANICZNEGO (TOC) I WYKONANIE NOMOGRAMU ZAWARTOŚCI TOC W POKARMIE GLONOWYM

Uwzględniając, że zawartość węgla w pokarmie glonowym nie będzie mierzona bezpośrednio, ale z korelacji (tj. nomogramów) z pomiarami zastępczymi, takimi jak ilość komórek glonowych lub absorbancja światła.

TOC powinien być zmierzony raczej wysokotemperaturowym utlenieniem, niż ultrafioletem lub metodą nadsiarczanową. (Patrz: The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).

Dla wykonania nomogramu glony powinny być oddzielone od ośrodka rozwoju poprzez odwirowanie następujące po ponownym utworzeniu zawiesiny w wodzie destylowanej. Pomiar zastępczego parametru i stężenia TOC w każdej potrojonej próbce. Destylowana woda jako ślepa próba powinna być zanalizowana, a stężenie TOC wydedukowane ze stężenia próbki glonów o danym TOC.

Nomogram musi być liniowy ponad wymagany zakres stężenia węgla. Przykłady pokazano poniżej.

Nb.: Nie powinno to być zastosowane do konwersji; istotne jest, aby laboratorium przygotowało swoje własne nomogramy.

_grafika

DODATEK 3

PRZYKŁADOWY ARKUSZ DANYCH ZAPISU WYMIANY OŚRODKA, DANYCH FIZYKOCHEMICZNYCH MONITOROWANIA, KARMIENIA, ROZRODCZOŚCI DAPHNIA I ŚMIERTELNOŚCI DOROSŁYCH

_grafika

DODATEK 4

PRZYKŁADOWY ARKUSZ DANYCH DOTYCZĄCYCH ZAPISU WYNIKÓW ANALIZY CHEMICZNEJ

a) Pomierzone stężenia

Stężenie nominalne	Próbka tydzień 1		Próbka tydzień 2		Próbka tydzień 3
Stężenie nominalne	Świeża	Stara	Świeża	Stara	Świeża	Stara

b) Pomierzone stężenia jako procent nominału

Stężenie nominalne	Próbka tydzień 1		Próbka tydzień 2		Próbka tydzień 3
Stężenie nominalne	Świeża	Stara	Świeża	Stara	Świeża	Stara

DODATEK 5

OBLICZANIE ŚREDNIEJ WAŻONEJ CZASU

Średnia ważona czasu

Podane stężenie substancji badanej może wypaść w okresie czasu między odnawianiami ośrodka, dlatego konieczne jest aby uważać, które stężenie powinno być wybrane jako reprezentatywne w zakresie stężeń doświadczanych przez dorosłe Daphnia. Wybór powinien być oparty na zarówno rozważaniach biologicznych jak i statystycznych. Na przykład, jeśli sądzi się, że rozrodczość podlega doświadczalnie głównie maksymalnemu stężeniu, wtedy należy użyć maksymalnego stężenia. Jednakże jeśli skumulowane lub długoterminowe działanie substancji toksycznej jest uznawane za najważniejsze, wtedy bardziej właściwe jest średnie stężenie. W takim przypadku, stosowną średnią do zastosowania jest czasowo ważona średnia stężenia, ponieważ uwzględnia zmiany w chwilowym stężeniu czasowym.

_grafika

Rysunek 1: Przykład średniej ważonej czasu

Rysunek 1 wskazuje przykład (uproszczony) badania trwającego siedem dni z odnowieniem ośrodka w dniach 0, 2 i 4.

- Cienka zygzakowata linia przedstawia stężenie w każdym punkcie czasu. Spadek stężenia ocenia się jako proces wykładniczy zanikający.

- Sześć wykreślonych punktów przedstawia pomierzone stężenia na początku i na końcu czasu każdego odnowienia.

- Gruba linia pokazuje położenie czasowo ważonej średniej.

Średnia ważona czasu jest obliczana tak, aby powierzchnia pod średnią ważoną była równa powierzchni pod krzywą stężenia. Obliczenia w odniesieniu do powyższego przykładu zilustrowano w tabeli 1.

Tabela 1: Obliczanie średniej ważonej czasu

Odnowienie nr	Dni	Conc0	Concl	Ln(Conc0)	Ln(Conc1)	Powierzchnia
1	2	10,000	4,493	2,303	1,503	13,767
2	2	11,000	6,037	2,398	1,798	16,544
3	3	10,000	4,066	2,303	1,403	19,781
Suma dni: 7					Suma powierzchni	50,091
					Średnia TW	7,156

"Dni" jest ilością dni w okresie odnowienia.

"Conc0" jest zmierzonym stężeniem na początku każdego okresu odnowienia.

"Conc1" jest zmierzonym stężeniem na końcu każdego okresu odnowienia.

"Ln(Conc0)" jest naturalnym logarytmem stężenia 0.

"Ln(Conc1)" jest naturalnym logarytmem stężenia 1.

"Powierzchnia" jest powierzchnią pod krzywą wykładniczą dla każdego okresu odnowienia. Jest obliczona za pomocą:

Średnia ważona czasu ("średnia TW") jest "całkowitą powierzchnią" podzieloną przez "sumę dni".

Oczywiście w odniesieniu do badania rozrodczości Daphnia tabela musi być rozszerzona aby objąć 21 dni.

Jest wiadome, że gdy podejmuje się obserwację tylko na początku i na końcu każdego okresu odnawiania, nie jest możliwe stwierdzenie, że proces spadku jest rzeczywiście gwałtowny. Różne krzywe powstają przy różnych obliczeniach dla "powierzchni". Jednakże wykładniczy proces zanikający nie jest nieprawdopodobny oraz jest prawdopodobnie najlepszą krzywą do zastosowania wobec braku innych informacji.

Wymagana jest jednak uważna praca, jesli analiza chemiczna nie odkryje jakiejś substancji na końcu okresu odnowienia. O ile możliwe jest oszacowanie, jak szybko substancja zniknęła z roztworu, niemożliwe jest uzyskanie rzeczywistej powierzchni pod krzywą, a stąd niemożliwe jest uzyskanie wiarygodnej średniej ważonej czasu.

ZAŁĄCZNIK 6

ZAŁĄCZNIK VI

OGÓLNA KLASYFIKACJA I WYMAGANIA W ZAKRESIE ETYKIETOWANIA SUBSTANCJI I PREPARATÓW NIEBEZPIECZNYCH

Treść

1.	WPROWADZENIE OGÓLNE
2.	KLASYFIKACJA NA PODSTAWIE WŁAŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNYCH
2.1.	Wprowadzenie
2.2.	Kryteria dotyczące klasyfikacji, wyboru symboli, etykietowania, niebezpieczeństwa, wyboru oznaczeń ryzyka "R"
2.2.1.	Substancje wybuchowe
2.2.2.	Substancje utleniające
2.2.3.	Substancje skrajnie łatwopalne
2.2.4.	Substancje wysoce łatwopalne
2.2.5.	Substancje łatwopalne
2.2.6.	Inne właściwości fizykochemiczne
3.	KLASYFIKACJA NA PODSTAWIE WŁAŚCIWOŚCI TOKSYKOLOGICZNYCH
3.1.	Wprowadzenie
3.2.	Kryteria dotyczące klasyfikacji, wyboru symboli, etykietowania niebezpieczeństwa, wyboru oznaczeń ryzyka "R"
3.2.1.	Substancje bardzo toksyczne
3.2.2.	Substancje toksyczne
3.2.3.	Substancje szkodliwe
3.2.4.	Uwagi odnoszące się do użycia R48
3.2.5.	Substancje żrące
3.2.6.	Substancje drażniące
3.2.7.	Substancje uczulające
3.2.8.	Inne właściwości toksykologiczne
4	KLASYFIKACJA NA PODSTAWIE SZCZEGÓLNYCH SKUTKÓW DLA ZDROWIA CZŁOWIEKA
4.1.	Wprowadzenie
4.2.	Kryteria dotyczące klasyfikacji, wyboru symboli, etykietowania niebezpieczeństwa, wyboru oznaczeń ryzyka "R"
4.2.1.	Substancje rakotwórcze
4.2.2.	Substancje mutagenne
4.2.3.	Substancje toksyczne dla rozrodczości
4.2.4.	Procedura klasyfikacji preparatów, dotycząca szczególnych skutków dla zdrowia
5.	KLASYFIKACJA NA PODSTAWIE WPŁYWU NA ŚRODOWISKO NATURALNE
5.1.	Wprowadzenie
5.2.	Kryteria dotyczące klasyfikacji, wyboru symboli, etykietowania niebezpieczeństwa, wyboru oznaczeń ryzyka "R"
5.2.1.	Środowisko wodne
5.2.2.	Środowisko niewodne
6.	WYBÓR WYRAŻEŃ ZALECAJĄCYCH BEZPIECZEŃSTWO
6.1.	Wprowadzenie
6.2.	Oznaczenia dotyczące bezpieczeństwa, dotyczące substancji i preparatów
7.	ETYKIETOWANIE
8.	SZCZEGÓLNE PRZYPADKI: Substancje
8.1.	Butle do transportu gazu
8.2.	Pojemniki na gaz przeznaczone dla propanu, butanu lub skroplonego gazu płynnego (LPG)
8.3.	Metale w postaci masowej
8.4.	Substancje sklasyfikowane przy pomocy R65
9.	SZCZEGÓLNE PRZYPADKI: Preparaty
9.1.	Preparaty gazowe (mieszaniny gazów)
9.2.	Pojemniki na gaz przeznaczone dla preparatów zawierających wonny propan, butan lub skroplonego gazu płynnego (LPG)
9.3.	Stopy, preparaty zawierające polimery, preparaty zawierające elastomery
9.4.	Preparaty sklasyfikowane przy pomocy R65
9.5.	Organiczne nadtlenki
9.6.	Dodatkowe wymagania dotyczące etykietowania niektórych preparatów

OŚWIADCZENIE KOMISJI

1. WPROWADZENIE OGÓLNE

1.1. Celem klasyfikacji jest określenie wszystkich fizykochemicznych, toksykologicznych i ekotoksykologicznych właściwości substancji i preparatów mogących stanowić zagrożenie podczas normalnej manipulacji lub stosowania. Określając wszystkie właściwości niebezpieczne, substancja lub preparat muszą zatem być etykietowane, aby wskazać niebezpieczeństwo(-a) w celu ochrony użytkownika, ogółu społeczeństwa i środowiska naturalnego.

1.2 Niniejszy załącznik ustanawia ogólne zasady dotyczące klasyfikacji i etykietowania substancji i preparatów określonych w art. 4 niniejszej dyrektywy i w art. 4 dyrektywy 1999/45/WE oraz innych odpowiednich dyrektywach dotyczących preparatów niebezpiecznych.

Jest on skierowany do tych wszystkich (producentów, importerów, władz krajowych), którzy zajmują się metodami klasyfikacji i etykietowania substancji i preparatów niebezpiecznych.

1.3.1. Wymagania niniejszej dyrektywy i dyrektywy 1999/45/WE mają na celu dostarczenie podstawowych pojęć, poprzez które ogół społeczeństwa i osoby w pracy otrzymują zasadnicze informacje o substancjach i preparatach niebezpiecznych. Etykieta zwraca uwagę osób manipulujących lub stosujących substancje i preparaty na nieodłączne niebezpieczeństwo niektórych takich materiałów.

Etykieta może również służyć zwróceniu uwagi na znacznie obszerniejsze informacje o produkcie dotyczące bezpieczeństwa i użycia dostępnego w innej formie.

1.4. Etykieta uwzględnia wszystkie potencjalne niebezpieczeństwa, które prawdopodobnie mogą wystąpić przy normalnym obchodzeniu się i użyciu substancji i preparatów niebezpiecznych w postaci, w jakiej są wprowadzone do obrotu, lecz niekoniecznie w jakiejkolwiek formie, w której mogą być ostatecznie używane, np. rozpuszczone. Niebezpieczeństwa wyższego stopnia są podkreślone przez symbole, takie niebezpieczeństwa i te powstające z innych niebezpiecznych właściwości są określone w standardowych wyrażeniach dotyczących zagrożenia i wyrażenia zalecające bezpieczeństwo radzą co do niezbędnych środków ostrożności.

W przypadku substancji informacja jest uzupełniana przez nazwę substancji na podstawie uznanej międzynarodowej nomenklatury chemicznej, preferowaną nazwą, która jest używana w Europejskim Spisie Istniejących Substancji Chemicznych o Znaczeniu Handlowym (EINECS) lub w Europejskim Wykazie Zgłoszonych Substancji Chemicznych (ELINCS), liczbę WE i nazwisko, adres i numer telefonu osoby prowadzącej działalność gospodarczą we Wspólnocie, która jest odpowiedzialna za wprowadzanie substancji do obrotu.

W przypadku preparatów informacje zgodnie z art. 10 ust. 2 dyrektywy 1999/45/WE, są uzupełniane:

- nazwę handlową lub oznaczenie preparatu,

- chemiczną nazwę substancji obecnych w preparacie, oraz

- nazwisko, pełny adres i numer telefonu osoby prowadzącej działalność gospodarczą we Wspólnocie, która jest odpowiedzialna za wprowadzanie preparatu do obrotu.

1.5. Art. 6 wymaga, aby producenci, dystrybutorzy i importerzy substancji niebezpiecznych, które znajdują się w EINECS, lecz które nie zostały jeszcze wprowadzone do załącznika I, byli zobowiązani do przeprowadzenia badań w celu uzyskania informacji o odpowiednich i dostępnych istniejących danych dotyczących właściwości takich substancji. Na podstawie tych informacji pakują oni i tymczasowo etykietują te substancje, zgodnie z regułami określonymi w art. 22-25 i kryteriami w niniejszym załączniku.

1.6. Dane wymagane do klasyfikacji i etykietowania

1.6.1. W odniesieniu do substancji wymagane dane do klasyfikacji i etykietowania można uzyskać:

a) odnośnie do substancji, dla których wymagane są informacje określone w załączniku VII, większość danych koniecznych do klasyfikacji i etykietowania jest zamieszczona w "podstawowym zestawie". Niniejsza klasyfikacja i etykietowanie muszą być poddane przeglądowi, jeśli to konieczne, gdy dalsze informacje są dostępne (załącznik VIII);

b) odnośnie do innych substancji (np. tych określonych w ppkt 1.5) dane wymagane do klasyfikacji i etykietowania mogą być, jeśli to konieczne, uzyskane z kilku różnych źródeł, na przykład:

- wyników poprzednich badań,

- informacji wymaganych przez międzynarodowe reguły transportu substancji niebezpiecznych,

- informacji uzyskanych z prac bibliograficznych i literatury, lub

- informacji pochodzących się z praktycznego doświadczenia.

Wyniki potwierdzonych stosunków struktura-działanie i orzeczenia ekspertów mogą również być uwzględniane w odpowiednim przypadku.

1.6.2. W odniesieniu do preparatów dane wymagane do klasyfikacji i etykietowania mogą być zwykle uzyskiwane z:

a) jeśli dotyczy to danych fizykochemicznych, poprzez zastosowanie metod określonych w załączniku V. Stosuje się to również do preparatów objętych dyrektywą 91/414/EWG, chyba że inne międzynarodowo uznane metody są dopuszczalne zgodnie z przepisami załączników II i III do dyrektywy 91/414/EWG (art. 5 ust. 5 dyrektywy 1999/45/WE). W odniesieniu do preparatów gazowych może być zastosowana metoda obliczeń dla palnych i utleniających właściwości (patrz ppkt 9.1.1.1 i 9.1.1.2). W odniesieniu do niegazowych preparatów zawierających nadtlenki organiczne metoda obliczeń może być zastosowana dla właściwości utleniających (patrz ppkt 2.2.2.1);

b) jeśli dotyczy to danych odnoszących się do wpływu na zdrowie:

- poprzez zastosowanie metod określonych w załączniku V, chyba że w przypadku produktów ochrony roślin inne międzynarodowo uznane metody są dopuszczalne zgodnie z przepisami załączników II i III do dyrektywy 91/414/EWG (art. 6 ust. 1 lit. b) dyrektywy 1999/45/WE),

- i/lub poprzez zastosowanie konwencjonalnych metod określonych w art. 6 i części A.1-6 i B.1-5 załącznika II do dyrektywy 1999/45/WE, lub

- w przypadku R65 przez zastosowanie reguł na podstawie ppkt 3.2.3,

- jednakże jeśli dotyczy to oceny właściwości rakotwórczych, mutagennych i toksycznych dla rozrodczości, poprzez zastosowanie konwencjonalnych metod określonych w art. 6 i w części A.7-9 i B.6 załącznika II do dyrektywy 1999/45/WE;

c) jeśli dotyczy to danych odnoszących się do właściwości ekotoksykologicznych:

i) tylko w odniesieniu do toksyczności dla środowiska wodnego:

- poprzez zastosowanie metod określonych w załączniku V, z zastrzeżeniem warunków określonych w części C załącznika III do dyrektywy 1999/45/WE, chyba że w przypadku produktów ochrony roślin inne międzynarodowo uznane metody są dopuszczalne zgodnie z przepisami załączników II i III do dyrektywy 91/414/EWG (art. 7 ust. 1 lit. b) dyrektywy 1999/45/WE), lub

- poprzez zastosowanie konwencjonalnych metod określonych w art. 7 i w części A i B załącznika III do dyrektywy 1999/45/WE;

ii) w odniesieniu do oceny potencjalnej (lub faktycznej) bioakumulacji poprzez oznaczenie log Pow (lub BCF), lub ocenę degradowalności przez zastosowanie konwencjonalnych metod określonych w art. 7 i w części A i B załącznika III do dyrektywy 1999/45/WE;

iii) w odniesieniu do niebezpiecznych dla warstwy ozonowej poprzez zastosowanie metody konwencjonalnej określonej w art. 7 i w częściach A i B załącznika III do dyrektywy 1999/45/WE.

Uwaga dotycząca badań wykonywanych na zwierzętach:

Wykonywanie badań na zwierzętach w celu ustalenia danych doświadczalnych podlega przepisom dyrektywy 86/609/EWG dotyczącej ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów doświadczalnych.

Uwaga dotycząca właściwości fizykochemicznych:

Dane dotyczące nadtlenków organicznych i preparatów nadtlenków organicznych mogą być uzyskane z metody obliczeń określonej w ppkt 9.5. W odniesieniu do gazowych preparatów może być zastosowana metoda obliczeń dla palnych i utleniających właściwości (patrz pkt 9).

1.7. Zastosowanie kryteriów przewodnich

Klasyfikacja musi obejmować właściwości fizykochemiczne, toksykologiczne i ekotoksykologiczne substancji i preparatów.

Klasyfikacja substancji i preparatów jest wykonywana zgodnie z ppkt 1.6, na podstawie kryteriów pkt 2-5 (substancje) i pkt 2, 3, pkt 4.2.4 i pkt 5 niniejszego załącznika. Wszystkie rodzaje niebezpieczeństwa muszą być rozważone. Na przykład klasyfikacja na podstawie ppkt 3.2.1 nie oznacza, że podpunkty takie jak 3.2.2 lub 3.2.4 mogą być zignorowane.

Wybór symbolu(-i) i oznaczenie(-a) dotyczące zagrożenia dokonywane jest na podstawie klasyfikacji w celu zapewnienia, aby określony charakter potencjalnego niebezpieczeństwa zidentyfikowany w klasyfikacji był wyrażony na etykiecie.

Bez względu na kryteria określone w ppkt 2.2.3, 2.2.4 i 2.2.5 substancje i preparaty w postaci aerozoli podlegają przepisom dyrektywy 75/324/EWG ze zmianami i dostosowanymi do postępu technicznego.

1.7.1. Definicje

"Substancje" oznaczają pierwiastki chemiczne i ich związki w postaci naturalnej lub uzyskanej przez jakikolwiek proces produkcyjny, łącznie z każdym dodatkiem, konieczny do zachowania stabilności produktu oraz jakiekolwiek zanieczyszczenia wynikające z zastosowanego procesu produkcyjnego, lecz wykluczające jakiekolwiek rozpuszczalniki, mogące być oddzielone bez wpływu na stabilność substancji lub zmiany ich składu.

Substancje mogą być bardzo dobrze określone chemicznie (np. aceton) lub złożoną mieszaniną tworzącą zmienny skład (np. destylaty aromatyczne). W odniesieniu do niektórych kompleksowych substancji określono niektóre ich składniki.

"Preparaty" oznaczają mieszaniny lub roztwory złożone z dwóch lub więcej substancji.

1.7.2. Zastosowanie kryteriów przewodnich dotyczących substancji.

Wytyczne określone w niniejszym załączniku są stosowane bezpośrednio, gdy omawiane dane uzyskano z metod badań porównywalnych z tymi opisanymi w załączniku V. W innych przypadkach dostępne dane muszą być ocenione przez porównanie użytych metod badań z tymi wskazanymi w załączniku V i regułami określonymi w niniejszym załączniku dla określenia właściwej klasyfikacji i etykietowania.

W niektórych przypadkach mogą istnieć wątpliwości co do zastosowania odpowiednich kryteriów, w szczególności w przypadku gdy wymagają orzeczenia eksperta. W takich przypadkach producent, dystrybutor lub importer powinni tymczasowo sklasyfikować i etykietować substancję na podstawie oceny dokumentów przez kompetentną osobę.

Bez uszczerbku dla art. 6, w przypadku gdy powyższa procedura została zastosowana i rozważane są możliwe niekonsekwencje, wtedy można złożyć propozycję wpisania tymczasowej klasyfikacji do załącznika I. Propozycja powinna być złożona jednemu z Państw Członkowskich i powinny jej towarzyszyć właściwe dane naukowe (patrz także ppkt 4.1).

Podobna procedura może być stosowana po określeniu informacji dającej podstawy do rozważań o trafności istniejącej pozycji w załączniku I.

1.7.2.1. Klasyfikacja substancji zawierających zanieczyszczenia, dodatki lub pojedyncze składniki

W przyadku gdy zanieczyszczenia, dodatki lub pojedyncze składniki substancji zostały określone, są one uwzględniane, jeśli ich stężenie jest większe lub równe określonym granicom:

- 0,1% dla substancji sklasyfikowanych jako bardzo toksyczne, toksyczne, rakotwórcze (kategoria 1 lub 2) mutagenne (kategorie 1 lub 2), toksyczne dla rozrodczości (kategoria 1 lub 2), lub niebezpieczne dla środowiska naturalnego (oznaczone symbolem "N" dla środowiska wodnego, niebezpieczne dla warstwy ozonowej),

- 1% dla substancji sklasyfikowanych jako szkodliwe, żrące, drażniące, uczulające, rakotwórcze (kategoria 3), mutagenne (kategoria 3), toksyczne dla rozrodczości (kategoria 3) lub niebezpieczne dla środowiska naturalnego (nie oznaczone symbolem "N", to jest szkodliwe dla organizmów wodnych, mogą powodować długoterminowe niekorzystne skutki),

chyba, że niższe wartości zostały określone w załączniku I.

Z wyjątkiem substancji szczegółowo wymienionych w załączniku i klasyfikacja powinna być prowadzona zgodnie z wymogami art. 5, 6 i 7 dyrektywy Rady 1999/45/WE.

W przypadku azbestu (650-013-00-6) niniejsze ogólne reguły nie mają zastosowania, chyba że granice stężenia zostały ustalone w załączniku I. Substancje, w których jest obecny azbest, są klasyfikowane i etykietowane zgodnie z zasadami art. 6 niniejszej dyrektywy.

1.7.3. Zastosowanie kryteriów przewodnich dla preparatów.

Kryteria przewodnie określone w niniejszym załączniku są stosowane bezpośrednio, gdy omawiane dane uzyskano z metod badań porównywalnych z tymi opisanymi w załączniku V, z wyjątkiem kryteriów pkt 4 dla których stosowana jest tylko metoda konwencjonalna. Konwencjonalna metoda jest także stosowana w odniesieniu do kryteriów pkt 5, z wyjątkiem toksyczności dla środowiska wodnego, podlegającej warunkom określonym w części C załącznika III do dyrektywy 1999/45/WE. W odniesieniu do preparatów objętych dyrektywą 91/414/EWG dane dotyczące klasyfikacji i etykietowania są również dopuszczalne z innych międzynarodowo uznanych metod (patrz szczególne przepisy w ppkt 1.6 niniejszego załącznika). W innych przypadkach dostępne dane muszą być ocenione przez porównanie metod badań zastosowanych z tymi wskazanymi w załączniku V oraz regułami określonymi w niniejszym załączniku w odniesieniu do ustalenia właściwej klasyfikacji i etykietowania.

W przypadku gdy niebezpieczeństwo dla zdrowia i środowiska są szacowane przez zastosowanie metody konwencjonalnej określonej w art. 6 i 7 i w załącznikach II i III do dyrektywy 1999/45/WE indywidualnymi granicami stężeń, które mają być zastosowane, są te określone:

- w załączniku I do niniejszej dyrektywy, albo

- w części B załącznika II i/lub w części B załącznika III do dyrektywy 1999/45/WE, w przypadku gdy substancja lub substancje nie znajdują się w załączniku I do niniejszej dyrektywy lub są wskazane bez granic stężeń.

W przypadku preparatów zawierających mieszaniny gazów klasyfikacja w odniesieniu do wpływu na zdrowie i środowisko naturalne jest ustalana metodą obliczeń na podstawie indywidualnych granic stężeń z załącznika i do niniejszej dyrektywy lub, gdy tych limitów nie ma w załączniku I, na podstawie kryteriów załączników II i III do dyrektywy 1999/45/WE.

1.7.3.1. Preparaty lub substancje opisane w ppkt 1.7.2.1 używane jako składniki innych preparatów

Etykietowanie takich preparatów musi odpowiadać przepisom art. 10 zgodnie z zasadami określonymi w art. 3 i 4 dyrektywy 1999/45/WE. Jednakże w niektórych przypadkach informacje na etykiecie preparatu lub substancji opisanych w ppkt 1.7.2.1 są niewystarczające, aby umożliwić innym producentom, którzy chcą je użyć jako składnik ich własnego(-ych) preparatu(-ów), przeprowadzenie prawidłowo klasyfikacji i etykietowania ich preparatu(-ów).

W tych przypadkach osoba prowadząca działalność we Wspólnocie odpowiedzialna za wprowadzanie pierwotnych preparatów i substancji opisanych w ppkt 1.7.2.1 do obrotu, czy będzie to producent, importer lub dystrybutor, dostarcza na uzasadnione żądanie i tak szybko jak to możliwe wszystkie niezbędne dane dotyczące istniejących substancji niebezpiecznych w celu zapewnienia prawidłowej klasyfikacji i etykietowania nowego preparatu. Dane te są również niezbędne, aby umożliwić osobie odpowiedzialnej za wprowadzenia nowych preparatów do obrotu spełnienie innych wymagań dyrektywy 1999/45/WE.

2. KLASYFIKACJA NA PODSTAWIE WŁAŚCIWOŚCI FIZYKOCHEMICZNYCH

2.1. Wprowadzenie

Metody badania wiążące się z właściwościami wybuchowymi, utleniającymi i palnymi zawarte w załączniku V służą określeniu szczególnego znaczenia ogólnym definicjom podanym w art. 2 ust. 2 lit. a)-e). Kryteria wynikają bezpośrednio z metod badań w załączniku V w zakresie, w jakim są wymienione.

Jeśli odpowiednie informacje są dostępne, aby pokazać w praktyce, że właściwości fizykochemiczne substancji i preparatów (bez organicznych nadtlenków) są różne od tych ujawnionych przez metody badań podane w załączniku V, wtedy takie substancje i preparaty powinny być sklasyfikowane według niebezpieczeństwa, jakie stanowią, jeśli jakiekolwiek występuje, dla ludzi manipulujących substancjami i preparatami lub dla innych osób.

2.2. Kryteria dotyczące klasyfikacji, wyboru symboli, oznaczenia niebezpieczeństwa i wyboru wyrażeń oznaczających zagrożenie

W przypadku preparatów należy uwzględnić kryteria określone w art. 5 dyrektywy 1999/45/WE.

2.2.1. Substancje wybuchowe

Substancje i preparaty są sklasyfikowane jako wybuchowe i oznaczone symbolem "E" oraz oznaczeniem niebezpieczeństwa "wybuchowy" zgodnie z wynikami badań podanych w załączniku V, o ile preparaty i substancje wprowadzone do obrotu mają właściwości wybuchowe. Jedno wyrażenie oznaczające zagrożenie jest obowiązkowe, ma ono być określone na podstawie następujących kryteriów:

R2 Zagrożenie wybuchem wskutek uderzenia, tarcia, ognia lub innych źródeł zapłonu

- Substancje i preparaty, z wyjątkiem tych określonych poniżej.

R3 Skrajne zagrożenie wybuchem wskutek uderzenia, tarcia, ognia lub innych źródeł zapłonu

- Substancje i preparaty, które są szczególnie sensytywne, takie jak kwas pikrynowy lub PETN.

2.2.2. Substancje utleniające

Substancje i preparaty są sklasyfikowane jako utleniające i oznaczone symbolem "O" oraz oznaczeniem niebezpieczeństwa "materiał utleniający" zgodnie z wynikami badań podanych w załączniku V. Jedno wyrażenie oznaczające niebezpieczeństwo jest obowiązkowe, ma ono być określone na podstawie wyników badań, ale z zastrzeżeniem następujących kryteriów:

R7 Może spowodować pożar

- Organiczne nadtlenki, które posiadają właściwości zapalne, nawet gdy nie są w kontakcie z innym palnym materiałem.

R8 Kontakt z materiałami palnymi może spowodować pożar

- Inne utleniające substancje i preparaty, włączając nieorganiczne nadtlenki, które mogą spowodować pożar lub zwiększyć zagrożenie pożarowe, gdy są w kontakcie z materiałem palnym.

R9 Wybucha po zmieszaniu z materiałem palnym

- Inne substancje i preparaty, włączając nieorganiczne nadtlenki, które stają się wybuchowe po zmieszaniu z materiałami palnymi, np. niektóre chlorany.

2.2.2.1. Uwagi dotyczące nadtlenków

Z powodu właściwości wybuchowych organiczne nadtlenki lub ich preparaty w postaci, w jakiej są wprowadzone do obrotu, są klasyfikowane zgodnie z kryteriami w ppkt 2.2.1 na podstawie badań przeprowadzonych zgodnie z metodami podanymi w załączniku V.

Z powodu właściwości utleniających metody podane w załączniku V nie mogą być zastosowane do nadtlenków organicznych.

W odniesieniu do organicznych nadtlenków niesklasyfikowanych jako wybuchowe są klasyfikowane jako niebezpieczne na podstawie ich struktury (np. R-O-O-H; R₁-O-O-R₂).

Preparaty niesklasyfikowane jako wybuchowe są sklasyfikowane, stosując metodę obliczeń opartą na zawartości procentowej aktywnego tlenu, przedstawioną w ppkt 9.5.

Każdy organiczny nadtlenek lub jego preparat, niesklasyfikowany jako wybuchowy, jest klasyfikowany jako utleniający, jeżeli nadtlenek lub jego preparaty zawierają:

- więcej niż 5% nadtlenku organicznego, lub

- więcej niż 0,5% dostępnego tlenu z nadtlenku organicznego i więcej niż 5% nadtlenku wodoru.

2.2.3. Skrajnie łatwopalne

Substancje i preparaty są sklasyfikowane jako skrajnie łatwopalne i opisane symbolem "F+" i oznaczeniem niebezpieczeństwa "skrajnie łatwopalna" zgodnie z wynikami badań podanych w załączniku V. Oznaczenie ryzyka "R" przypisuje się zgodnie z następującymi kryteriami:

R12 Skrajnie łatwopalne

- Ciekłe substancje i preparaty posiadające temperaturę zapłonu poniżej 0° C, a temperaturę wrzenia (lub w przypadku zakresu temperatur wrzenia, temperaturę początkującą wrzenie) niższą lub równą 35 °C.

- Substancje gazowe i preparaty, które są palne w kontakcie z powietrzem w temperaturze i ciśnieniu otoczenia.

2.2.4. Wysoce łatwopalne

Substancje i preparaty są sklasyfikowane jako wysoce łatwopalne i oznaczone symbolem "F" oraz oznaczeniem niebezpieczeństwa "wysoce łatwopalne" zgodnie z wynikami badań podanych w załączniku V. Oznaczenia ryzyka "R" są przypisane zgodnie z następującymi kryteriami:

R11 Wysoce łatwopalne

- Substancje i preparaty w stanie stałym, które mogą łatwo zapalić się po krótkim kontakcie ze źródłem zapłonu i które kontynuują spalanie lub wypalają się po usunięciu źródła zapłonu.

- Ciekłe substancje i preparaty posiadające temperaturę zapłonu poniżej 21° C, lecz które nie są skrajnie łatwopalne.

R15 Kontakt z wodą uwalnia wysoce łatwopalne gazy

- Substancje i preparaty, które w kontakcie z wodą lub wilgotnym powietrzem wydzielają skrajnie łatwopalne gazy w niebezpiecznych ilościach, z szybkością minimum 1 litr na kilogram na godzinę.

R17 Samorzutnie zapala się w powietrzu

- Substancje i preparaty, które mogą rozgrzać się i w rezultacie zapalić się w kontakcie z powietrzem w temperaturze otoczenia, bez dodatkowego dostarczenia energii.

2.2.5. Łatwopalne

Substancje i preparaty są sklasyfikowane jako łatwopalne zgodnie z wynikami badań podanych w załączniku V. Wyrażenia oznaczające zagrożenie przypisane są zgodnie z następującymi kryteriami:

R10 Łatwopalne

- Ciekłe substancje i preparaty posiadające temperaturę zapłonu równą lub większą niż 21° C, i mniejszą lub równą 55° C.

Jednakże wykazano w praktyce, że preparaty mające temperaturę zapłonu równą lub większą niż 21° C i mniejszą lub równą 55° C nie wymagają klasyfikowania jako łatwopalne, jeśli preparat w żaden sposób nie podtrzymuje spalania, a także nie ma powodu do obawy o ryzyko dla osób manipulujących tymi preparatami lub dla innych osób.

2.2.6. Inne właściwości fizykochemiczne

Dodatkowe wyrażenia oznaczające zagrożenie są przypisane substancjom i preparatom, które zostały sklasyfikowane na mocy ppkt 2.2.1-2.2.5 lub za pomocą ppkt 3, 4 i 5, zgodnie z następującymi kryteriami (opartymi na doświadczeniu uzyskanym w trakcie uzupełniania załącznika I):

R1 Wybucha w stanie suchym

Dla wybuchowych substancji i preparatów wprowadzanych do obrotu w postaci roztworu lub w postaci mokrej, np. nitroceluloza, o zawartości azotu większej niż 12,6%.

R4 Stanowi łatwo wybuchające związki metaliczne

Dla substancji i preparatów, które mogą stanowić łatwo wybuchające związki metaliczne, np. kwas pikrynowy, kwas styfninowy.

R5 Ogrzanie grozi wybuchem

Dla termicznie nietrwałych substancji i preparatów niesklasyfikowanych jako wybuchowe, np. kwas nadchlorowy o stężeniu > 50%.

R6 Wybucha w kontakcie z powietrzem lub bez powietrza

Dla substancji i preparatów, które są nietrwałe w temperaturze otoczenia, np. acetylen.

R7 Może spowodować pożar

Dla reaktywnych substancji i preparatów, np. fluor, podsiarczyn sodowy.

R14 Reaguje gwałtownie z wodą

Dla substancji i preparatów, które reagują gwałtownie z wodą, np. chlorek acetylu, metale alkaliczne, tetrachlorek tytanu.

R16 Wybucha po zmieszaniu z substancjami utleniającymi

Dla substancji i preparatów, które reagują wybuchowo ze środkiem utleniającym, np. czerwony fosfor.

R18 Podczas stosowania może tworzyć łatwopalne/wybuchowe mieszaniny para/powietrze

Dla preparatów niesklasyfikowanych samych w sobie jako łatwopalne, ale które zawierają lotne składniki łatwopalne w powietrzu.

R19 Może tworzyć wybuchowe nadtlenki

Dla substancji i preparatów, które mogą tworzyć wybuchowe nadtlenki w czasie przechowywania, np. eter dietylu, 1,4-dioxan.

R30 Staje się wysoce palny podczas użycia

Dla preparatów niesklasyfikowanych samych w sobie jako łatwopalne, które mogą stać się łatwopalnymi przy utracie lotnych niełatwopalnych składników.

R44 Ryzyko wybuchu przy podgrzaniu w zamknięciu

Dla substancji i preparatów niesklasyfikowanych samych w sobie jako wybuchowe, zgodnie z ppkt 2.2.1 powyżej, ale które mogą pomimo to okazać się wybuchowe w praktyce, jeśli będą ogrzewane w wystarczająco zamkniętych naczyniach. Na przykład niektóre substancje, które mogą rozkładać się wybuchowo po podgrzaniu w stalowym bębnie, nie wykazują takiego skutku, jeśli są ogrzewane w otwartych pojemnikach.

Dla innych dodatkowych sformułowań dotyczących zagrożenia patrz ppkt 3.2.8.

3. KLASYFIKACJA NA PODSTAWIE WŁAŚCIWOŚCI TOKSYKOLOGICZNYCH

3.1. Wprowadzenie

3.1.1. Klasyfikacja dotyczy zarówno ostrego, jak i długotrwałego skutku działania substancji i preparatów, czy też wynikającego z jednorazowej, powtarzalnej czy długotrwałej ekspozycji.

W przypadku gdy można przedstawić przy pomocy badań epidemiologicznych, w naukowo wiarygodnych przypadkach badań, jak określono w niniejszym załączniku lub przez statystycznie wsparte doświadczenie, takie jak ocena danych z jednostek informacyjnych o truciznach lub chorobach zawodowych, że wpływ toksykologiczny na człowieka różni się od tych sugerowanych z zastosowania metod określonych w zarysie w ppkt 1.6 niniejszego załącznika, wtedy substancja lub preparat są sklasyfikowane zgodnie z ich wpływem na człowieka. Jednakże badania na człowieku nie mogą być zwykle stosowane do negacji pozytywnych danych uzyskanych ze zwierzętami.

Dyrektywa 86/609/EWG ma na celu ochronę zwierząt wykorzystywanych do doświadczeń i innych naukowych celów. W odniesieniu do kilku punktów końcowych istnieją wiarygodne metody badania in vitro w załączniku V do niniejszej dyrektywy, a te badania powinny być wykorzystane tam, gdzie to jest stosowne.

3.1.2. Klasyfikacja substancji musi być wykonana na bazie dostępnych danych doświadczalnych, zgodnie z następującymi kryteriami, które uwzględniają wielkość tych skutków:

a) w przypadku toksyczności ostrej (śmiertelne lub nieodwracalne działanie po jednorazowej ekspozycji), kryteria ppkt 3.2.1-3.2.3 mają być zastosowane;

b) w przypadku toksyczności podostrej, podprzewlekłej lub przewlekłej kryteria ppkt 3.2.2-3.2.4 mają być zastosowane;

c) w przypadku działania żrącego i drażniącego, kryteria ppkt 3.2.5 i 3.2.6 mają być zastosowane;

d) w przypadku działania uczulającego zastosowano kryteria ppkt 3.2.7 mają być zastosowane;

e) w przypadku szczególnego wpływu na zdrowie (rakotwórcza, mutageniczna i rozrodcza toksyczność), kryteria pkt 4 mają być zastosowane.

3.1.3. W odniesieniu do preparatów klasyfikację dotyczącą niebezpieczeństwa dla zdrowia przeprowadzono:

a) na podstawie metody konwencjonalnej określonej w art. 6 i w załączniku II do dyrektywy 1999/45/WE przy braku danych doświadczalnych. W tym przypadku klasyfikacja jest oparta na granicach stężeń indywidualnych:

- uzyskanych z załącznika i do niniejszej dyrektywy, albo

- z części B załącznika II do dyrektywy 1999/45/WE, w przypadku gdy substancja lub substancje nie znajdują się w załączniku i do niniejszej dyrektywy lub występują w nim bez granic stężeń;

b) lub gdy dane doświadczalne są dostępne zgodnie z kryteriami opisanymi w ppkt 3.1.2, wyłączając właściwości rakotwórcze, mutagenne i toksyczne dla rozrodczości, określone w ppkt 3.1.2 lit. e), które muszą być ocenione metodą konwencjonalną określoną w art. 6 i w części A.7-9 i części B.6 załącznika II do dyrektywy 1999/45/WE.

Uwaga: Bez uszczerbku dla wymagań dyrektywy 91/414/EWG, tylko w przypadku gdy osoba odpowiedzialna za wprowadzenie preparatu do obrotu może naukowo przedstawić, że toksykologiczne właściwości preparatu nie mogą być poprawnie ustalone metodą przedstawioną w ppkt 3.1.3 lit. a) lub na podstawie istniejących wyników badań na zwierzętach, metody przedstawione w ppkt 3.1.3 lit. b) mogą być zastosowane, pod warunkiem że są uzasadnione lub szczególnie upoważnione na podstawie art. 12 dyrektywy 86/609/EWG.

Jakakolwiek metoda jest zastosowana do oceny niebezpieczeństwa preparatu, należy uwzględnić wszelkie niebezpieczne skutki dla zdrowia, jak określono w części B załącznika II do dyrektywy 1999/45/WE.

3.1.4. Jeśli klasyfikacja ma być ustalona na podstawie wyników doświadczalnych uzyskanych z badań na zwierzętach, wyniki powinny być wiarygodne w odniesieniu do ludzi w zakresie mającym odzwierciedlenie dla ludzi, wskazując we właściwy sposób zagrożenia dla człowieka.

3.1.5. Ostra toksyczność drogą pokarmową substancji lub preparatów wprowadzonych do obrotu może być ustalona metodą pozwalającą ocenić wartość LD₅₀ albo przez określenie dawki różnicującej (metoda ustalonej dawki, lub przez określenie zakresu ekspozycji, w przypadku gdy śmiertelność jest oczekiwana (metoda klas toksyczności ostrej).

3.1.5.1. Dawka różnicująca jest dawką powodującą wyraźne działanie toksyczne, lecz nie śmiertelne oraz jest jednym z czterech poziomów dawkowania określonych w załączniku V (5, 50, 500 lub 2.000 mg na kg masy ciała).

Pojęcie "wyraźne działanie toksyczne" używane jest do wskazania skutków toksycznych, po ekspozycji badanej substancji, które są tak poważne, że ekspozycja następnej wyższej ustalonej dawki prawdopodobnie doprowadzi do śmierci.

Wyniki badania przy określonej dawce, stosując metodę ustalonych dawek, mogą być następujące:

- mniej niż 100% przeżycia,

- 100% przeżycia, lecz wyraźne działanie toksyczne,

- 100% przeżycia, lecz bez wyraźnego działania toksycznego.

W kryteriach w ppkt 3.2.1, 3.2.2 i 3.2.3 wskazano tylko wyniki końcowe badania. Dawka 2.000 mg/kg powinna być użyta wstępnie do uzyskania informacji dotyczących toksycznych skutków substancji, które są niższej toksyczności ostrej i które nie są sklasyfikowane na podstawie toksyczności ostrej.

Metoda ustalonej dawki wymaga w niektórych przypadkach badania wyższych lub niższych dawek, jeśli nie były już badane przy odpowiednim poziomie dawkowania. Należy się także odnieść do tabeli oceny w metodzie badania B.1a.

3.1.5.2. Zakres ekspozycji, przy którym spodziewana jest śmiertelność, pochodzi z obserwowanej nieobecności lub obecności substancji pokrewnej śmiertelności następującej po metodzie klasy toksyczności ostrej. W odniesieniu do wstępnego badania stosuje się jedną z trzech ustalonych dawek początkowych (25, 200 lub 2.000 mg na kg wagi ciała).

Metoda klasy toksyczności ostrej wymaga w niektórych przypadkach badania przy wyższych lub niższych dawkach, jeśli jeszcze nie badano przy odpowiednim poziomie dawki. Należy się także odnieść do schematu przebiegu procedury badania w metodzie B.1b załącznika V.

3.2. Kryteria dotyczące klasyfikacji, wyboru symboli, oznaczania niebezpieczeństwa, wyboru wyrażeń oznaczających zagrożenie

3.2.1. Bardzo toksyczne

Substancje i preparaty są sklasyfikowane jako bardzo toksyczne i oznaczone symbolem "T+" oraz oznaczeniem niebezpieczeństwa "bardzo toksyczne" zgodnie z kryteriami określonymi poniżej.

Wyrażenia oznaczające zagrożenie są przypisane zgodnie z następującymi kryteriami:

R28 Bardzo toksyczne w razie połknięcia

Wyniki toksyczności ostrej:

- LD₅₀ drogą pokarmową, szczur ≤ 25 mg/kg,

- mniej niż 100% szczurów przeżywa po podaniu drogą pokarmową 5 mg/kg, przy procedurze ustalonej dawki, lub

- wysoka śmiertelność przy dawkach ≤ 25 mg/kg drogą pokarmową, szczur, metodą klas toksyczności ostrej (w celu interpretacji wyników patrz przebieg procesu w dodatku 2 do metody B.1b załącznika V).

R27 Bardzo toksyczne w kontakcie ze skórą

Wyniki toksyczności ostrej:

- LD₅₀ naniesiony na skórę, szczur lub królik: ≤ 50 mg/kg.

R26 Bardzo toksyczne przy wdychaniu

Wyniki toksyczności ostrej:

- LC₅₀ wdychanie aerozolu lub cząstek stałych, szczur: ≤ 0,25 mg/litr/4h,

- LC₅₀ wdychanie gazów i par, szczur: ≤ 0,5 mg/litr/4h.

R39 Niebezpieczeństwo bardzo poważnych nieodwracalnych skutków

- Mocne dowody, że nieodwracalne uszkodzenia, inne od efektów określonych w pkt 4, mogą być spowodowane poprzez jednorazową ekspozycję właściwą drogą, ogólnie w wyżej wymienionym zakresie dawek.

W celu wskazania drogi podawania/ekspozycji wykorzystuje się jedną z następujących kombinacji: R39/26, R39/27, R39/28, R39/26/27, R39/26/28, R39/27/28, R39/26/27/28.

3.2.2. Toksyczne

Substancje i preparaty są sklasyfikowane jako bardzo toksyczne i oznaczone symbolem "T" oraz oznaczeniem niebezpieczeństwa "toksyczne" zgodnie z kryteriami podanymi poniżej. Wyrażenia oznaczające zagrożenie są przypisane zgodnie z następującymi kryteriami:

R25 Toksyczne w przypadku spożycia

Wyniki toksyczności ostrej:

- LD₅₀ drogą pokarmową, szczur: 25 < LD₅₀ ≤ 200 mg/kg,

- różnicowana dawka, drogą pokarmową, szczur, 5 mg/kg: 100% przeżywa, lecz wyraźne działanie toksyczne, lub

- wysoka śmiertelność w zakresie dawki > 25 to ≤ 200 mg/kg drogą pokarmową, szczur, metodą klas toksyczności ostrej (w celu interpretacji wyników patrz przebieg procesu w dodatku 2 do metody B.1b załącznika V).

R24 Toksyczne w kontakcie ze skórą

Wyniki toksyczności ostrej:

- LD₅₀ naniesiona na skórę, szczur lub królik: 50 < LD₅₀≤ 400 mg/kg.

R23 Toksyczne przy wdychaniu

Wyniki toksyczności ostrej:

- LC50 wdychanie aerozolu lub cząstek stałych, szczur: 0,25 < LC₅₀ ≤ 1 mg/litr/4h,

- LC50 wdychanie gazów i par, szczur: 0,5 < LC₅₀ ≤ 2 mg/litr/4h.

R39 Niebezpieczeństwo bardzo poważnych, nieodwracalnych zmian

- Mocne dowody, że nieodwracalne uszkodzenia, inne od skutków określonych w pkt 4, mogą być spowodowane poprzez jednorazową ekspozycję właściwą drogą, ogólnie w wyżej wymienionym zakresie dawek.

W celu wskazania drogi podawania/ekspozycji wykorzystuje się jedną z następujących kombinacji: R39/23, R39/24, R39/25, R39/23/24, R39/23/25, R39/24/25, R39/23/24/25.

R48 Niebezpieczeństwo poważnego ubytku zdrowia w czasie przedłużonej ekspozycji na działanie substancji

- poważne uszkodzenia (wyraźne zaburzenia funkcjonalne lub zmiany morfologiczne, mające toksykologiczne znaczenie) są prawdopodobnie spowodowane przez powtarzaną lub przedłużoną ekspozycję, właściwą drogą.

Substancje i preparaty są sklasyfikowane jako co najmniej toksyczne, gdy te skutki są obserwowane na poziomie niższym o jeden rząd (tzn. 10 razy) niż ten określony dla R48 w ppkt 3.2.3.

W celu wskazania drogi podawania/ekspozycji wykorzystuje się jedną z następujących kombinacji: R48/23, R48/24, R48/25, R48/23/24, R48/23/25, R48/24/25, R48/23/24/25.

3.2.3. Szkodliwe

Substancje i preparaty są sklasyfikowane jako szkodliwe i oznaczone symbolem "Xn" oraz oznaczeniem niebezpieczeństwa "szkodliwe" zgodnie z kryteriami podanymi poniżej. Wyrażenia oznaczające zagrożenie są przypisane zgodnie z następującymi kryteriami:

R22 Szkodliwy w razie połknięcia

Wyniki toksyczności ostrej:

- LD₅₀, drogą pokarmową, szczur: 200 < LD₅₀ ≤ 2.000 mg/kg,

- dawka różnicująca, drogą pokarmową, szczur 50 mg/kg: 100% przeżycia, lecz wyraźne działanie toksyczne,

- mniej niż 100% przeżycia przy 500 mg/kg, szczur, drogą pokarmową, procedura ustalonej dawki. Należy odnieść się do tabeli oceny w metodzie badania B.1a załącznika V, lub

- wysoka śmiertelność w zakresie dawek > 200 do ≤ 2.000 mg/kg drogą pokarmową, szczur, metodą klas toksyczności ostrej (w celu interpretacji wyników patrz przebieg procesu w dodatku 2 do metody B.1b załącznika V).

R21 Szkodliwe w kontakcie ze skórą

Wyniki toksyczności ostrej:

- LD₅₀ naniesiona na skórę, szczur lub królik: 400 < LD₅₀ ≤ 2.000 mg/kg.

R20 Szkodliwe przy wdychaniu

Wyniki toksyczności ostrej:

- LC₅₀ wdychanie, szczur, aerozol lub cząstki stałe: 1 < LC₅₀ ≤ 5 mg/litr/4h,

- LC₅₀ wdychanie, szczur, gazy lub pary: 2 < LC₅₀ ≤ 20 mg/litr/4h.

R65 Szkodliwe: może być przyczyną uszkodzenia płuc po spożyciu

Ciekłe substancje i preparaty przedstawiające niebezpieczeństwo wdychania przez człowieka z powodu swojej niskiej lepkości:

a) w odniesieniu do substancji i preparatów zawierających alifatyczne, alicykliczne i aromatyczne węglowodory o całkowitym stężeniu równym lub większym niż 10% i mających:

- czas przepływu mniejszy niż 30 s w 3-milimetrowym kubku ISO, zgodnie z ISO 2431 (kwiecień 1996/wydanie lipiec 1999) dotyczącej "Farby i lakiery - określenie czasu przepływu za pomocą kubków przepływowych",

- lepkość kinematyczna zmierzona za pomocą kalibrowanego wiskozymetru z kapilarą szklaną zgodnie z ISO 3104/3105 jest mniejsza niż 7 × 10^-6 m²/s w 40° C (ISO 3104, wydanie 1994 dotyczące "Produkty naftowe - przezroczyste i nieprzezroczyste ciecze - Określenie i obliczanie lepkości kinematycznej"; ISO 3105, wydanie 1994, dotyczące: "Wiskozymetry kinematyczne ze szklaną kapilarą - Specyfikacje i instrukcje obsługi"), lub

- lepkość kinematyczna uzyskana z pomiarów wiskozymetrem rotacyjnym zgodnie z ISO 3219 jest mniejsza niż 7 × 10^-6 m²/s w 40° C (ISO 3219, wydanie 1993 dotyczące: "Plastiki- Polimery/żywice w postaci stałej, emulsji lub dyspersji - oznaczanie lepkości za pomocą wiskozymetru rotacyjnego z określoną szybkością wrzeciona").

Należy zauważyć, że substancje i preparaty spełniające te kryteria nie muszą być klasyfikowane, jeśli posiadają one średnie napięcie powierzchniowe większe niż 33 mN/m w 25° C mierzone tensometrem du Nouya lub metodami badań wskazanymi w części A.5 załącznika V;

b) w odniesieniu do substancji i preparatów oparte na doświadczeniu praktycznym w odniesieniu do ludzi.

R68 Możliwe niebezpieczeństwo nieodwracalnych skutków

W celu wskazania drogi podawania/ekspozycji wykorzystuje się jedną z następujących kombinacji: R68/20, R68/21, R68/22, R68/20/21, R68/20/22, R68/21/22, R68/20/21/22.

R48 Niebezpieczeństwo poważnego uszkodzenia zdrowia przy przedłużonej ekspozycji

- poważne uszkodzenia (wyraźne zaburzenia funkcjonalne lub zmiany morfologiczne o znaczeniu toksykologicznym) spowodowane przez powtarzalną lub przedłużoną ekspozycję odpowiednią drogą.

Substancje i preparaty są sklasyfikowane jako co najmniej szkodliwe, gdy te skutki są obserwowane na poziomach o rzędzie wielkości:

- droga pokarmowa, szczur ≤ 50 mg/kg (masy ciała)/dzień,

- po naniesieniu na skórę, szczur lub królik ≤ 100 mg/kg (masy ciała)/dzień,

- inhalacja, szczur ≤ 0,25 mg/l przez 6 godzin/dzień.

Te wytyczne wartości można zastosować bezpośrednio, gdy zaobserwowano poważne uszkodzenia w podprzewlekłym (90-dniowym) badaniu toksyczności. Gdy interpretuje się wyniki badania toksyczności podostrej (28-dniowy), dane te powinny być zwiększone około trzykrotnie. Jeśli badanie toksyczności przewlekłej (dwa lata) są dostępne, powinny być oceniane na podstawie każdego przypadku. Jeśli są dostępne wyniki z ponad jednego okresu trwania, należy do rozważań przyjąć te o najdłuższym czasie.

W celu wskazania drogi podawania/ekspozycji wykorzystuje się jedną z następujących kombinacji: R48/20, R48/21, R48/22, R48/20/21, R48/20/22, R48/21/22, R48/20/21/22.

3.2.3.1. Uwagi odnoszące się do substancji lotnych

W odniesieniu do niektórych substancji o wysokim stężeniu pary nasyconej mogą być dostępne dowody wykazywania skutków, które mogą być przyczyną zainteresowania. Takie substancje nie mogą być sklasyfikowane zgodnie z kryteriami wpływu na zdrowie w niniejszej wytycznej (ppkt 3.2.3) lub nie są objęte ppkt 3.2.8. Jednakże w przypadku gdy istnieją stosowne dowody, że takie substancje mogą przedstawiać niebezpieczeństwo przy zwykłym manipulowaniu i użyciu, zachodzi konieczność klasyfikacji na podstawie indywidualnego przypadku w załączniku I.

3.2.4. Uwagi odnoszące się do użycia R48

Użycie niniejszego wyrażenia oznaczającego zagrożenie odnosi się do szczególnego zakresu skutków biologicznych w ramach pojęć opisanych poniżej. Celem zastosowania niniejszego oznaczenia muszą być rozważone poważne uszkodzenia zdrowia, włączając śmierć, wyraźne zaburzenia czynnościowe lub zmiany morfologiczne, które są znaczące toksykologicznie. Jest szczególnie ważne, czy zmiany te są nieodwracalne. Jest także ważne rozpatrzenie nie tylko poważnych szczególnych zmian w określonym narządzie lub systemie biologicznym, lecz także uogólnionych zmian o mniej istotnym charakterze, dotyczących kilku narządów lub poważnych zmian w ogólnym stanie zdrowia.

Celem oceny, czy istnieje dowód na występowanie tego rodzaju skutków, należy odnieść się do następujących wytycznych:

1. Dowody wskazujące, że R48 powinno być zastosowane:

a) substancje powodujące śmierć;

b) i) duże zmiany czynnościowe w ośrodkowym lub obwodowym układzie nerwowym, włączając wzrok, słuch i zmysł powonienia, oceniane klinicznie lub innymi metodami (np. elektrofizjologicznymi);

ii) duże zmiany czynnościowe w innych układach narządów (na przykład w płucach);

c) wszystkie wyraźne zmiany w klinicznych parametrach biochemicznych, hematologicznych i analizie moczu, wskazujące na poważne zaburzenia narządów. Hematologiczne zmiany uważane są za szczególnie ważne, jeśli dowody sugerują, że są odpowiadają one za obniżenie produkcji komórek krwi w szpiku kostnym;

d) poważne uszkodzenie narządu zaobserwowane badaniem mikroskopowym przy autopsji:

i) rozległe lub poważne martwice, zwłóknienia lub utworzenie się ziarniaków w narządach istotnych dla życia, mających właściwości regeneracyjne (np. wątroba);

ii) poważne zmiany morfologiczne, które chociaż są potencjalnie odwracalne, są wyraźnymi wskaźnikami zaburzeń narządów (np. poważne zmiany stłuszczające wątroby, poważne ostre uszkodzenie kanalików nerkowych w nerce, wrzodowy nieżyt żołądka); lub

iii) znaczące dowody obumierania tkanek w narządach istotnych dla życia, niezdolnych do regeneracji (np. zwłóknienie mięśnia sercowego lub zwyrodnienie wsteczne nerwów) lub w populacji komórek macierzystych (np. aplazja lub hypoplazja szpiku kostnego).

Powyższe dowody będą w większości uzyskane z doświadczeń na zwierzętach. Przy rozważaniu danych pochodzących z praktycznego doświadczenia należy zwrócić szczególną uwagę na poziomy ekspozycji.

2. Dowody wskazujące, że R48 nie powinien być stosowany:

Użycie niniejszego wyrażenia oznaczającego zagrożenie jest zastrzeżone dla "poważnego uszkodzenia zdrowia w czasie przedłużonej ekspozycji". Można zaobserwować wiele skutków, zarówno u ludzi, jak i u zwierząt, które nie stanowią podstawy użycia R48. Te skutki są istotne, gdy próbuje się określić nieoddziaływujący poziom substancji chemicznej.

Przykłady dobrze udokumentowanych zmian, które nie uzasadniają klasyfikacji z R48, niezależnie od ich istotności statystycznej, zawierają:

a) obserwacje kliniczne lub zmiany przyrostu masy ciała, spożycie pokarmów i wody, które mogą mieć ważność toksykologiczną, ale same w sobie, nie wskazują na "poważne uszkodzenie";

b) małe zmiany parametrów klinicznych biochemicznych, hematologicznych lub analizy moczu, które są wątpliwe lub o minimalnej istotności toksykologicznej;

c) zmiany w masie narządów, bez dowodów na dysfunkcję narządową;

d) adaptacyjne reakcje (np. migracja makrofagów w płucach, hipertrofia i indukcja enzymatyczna w wątrobie, przerostowe reakcje na podrażnienia). Skutki działania miejscowego na skórę przy powtarzalnym nakładaniu na skórę substancji są bardziej właściwiej sklasyfikowane przez R38 "drażniący dla skóry"; lub

e) gdy przedstawiono szczególny gatunkowo mechanizm toksyczności (np. specyficzne szlaki metaboliczne).

3.2.5. Żrące

Substancje i preparaty są sklasyfikowane jako żrące i oznaczone symbolem "C" oraz oznaczeniem niebezpieczeństwa "żrąca" zgodnie z następującymi kryteriami:

- substancje lub preparaty rozpatrywane jako żrące, jeśli po nałożeniu na zdrową, nieuszkodzoną skórę zwierzęcia spowodują całkowite zniszczenie tkanek skóry w całej grubości u co najmniej jednego zwierzęcia, w czasie trwania badania działania drażniącego na skórę cytowanego w załączniku V lub w czasie trwania badania metodą równoważną,

- klasyfikacja może być oparta na wynikach wiarygodnych badań in vitro, takich jak cytowane w załączniku V (B.40. Korozja skóry: oznaczanie transskórnego oporu elektrycznego skóry szczura i analiza modelu skóry ludzkiej),

- substancje i preparaty powinny być także uznane za żrące, jeśli wyniki mogą być przewidziane, na przykład dla reakcji na mocne kwasy lub zasady wykazujące pH równe lub mniejsze od 2, lub 11,5 lub więcej. Jednakże kiedy skrajne pH jest podstawą dla klasyfikacji, można uwzględnić również kwasowo/alkaliczną rezerwę⁽¹⁾. Jeśli uwzględnienie rezerwy kwasowo/alkalicznej sugeruje, że substancja lub preparat może nie być żrący, powinny być przeprowadzone dalsze badania dla potwierdzenia tego, wskazane jest użycie odpowiedniego, uznanego naukowo badania in vitro. Rozważenie samej rezerwy kwasowo/zasadowej nie powinno zwalniać od klasyfikacji substancji lub preparatów jako żrące.

Wyrażenia oznaczajace zagrożenie są przypisane zgodnie z następującymi kryteriami:

R35 Wywołuje poważne oparzenia

- gdy substancja zastosowana na zdrową, nieuszkodzoną skórę zwierząt powoduje zniszczenie tkanek skóry w całej grubości w wyniku ekspozycji trwającej do trzech minut lub jeśli ten wynik można przewidzieć.

R34 Wywołuje oparzenia

- gdy substancja zastosowana na zdrową, nieuszkodzoną skórę zwierząt powoduje zniszczenie tkanek skóry w całej grubości w wyniku ekspozycji trwającej do czterech godzin, lub jeśli ten wynik można przewidzieć,

- organiczne wodoronadtlenki, poza tymi, gdzie dostępne dowody są sprzeczne.

Uwagi:

W przypadku gdy klasyfikacja jest oparta na wynikach wiarygodnego badania in vitro R35 lub R34 stosuje się zgodnie ze zdolnością metody badania do rozróżnienia między nimi.

W przypadku gdy klasyfikacja jest oparta tylko na rozważeniu samego skrajnego pH, należy zastosować R35.

3.2.6. Drażniące

Substancje i preparaty są sklasyfikowane jako drażniące i oznaczone symbolem "Xi" oraz oznaczeniem niebezpieczeństwa "drażniące" zgodnie z kryteriami podanymi poniżej.

3.2.6.1. Stan zapalny skóry

Następujące wyrażenie oznaczające zagrożenie jest ustalone zgodnie z danymi kryteriami:

R38 Działa drażniąco na skórę

- Substancje i preparaty które powodują wyraźny stan zapalny skóry, utrzymujący się co najmniej 24 godziny od zakończenia ekspozycji trwającej do 4 godzin i odpowiada następującym wynikom ustalonym dla królika zgodnie z metodą badania podrażnienia skóry cytowanej w załączniku V.

Zapalenie skóry jest znaczne, gdy:

a) średnia wartość oceny punktowej albo dla tworzącego się rumieńca i strupa, albo tworzącego się obrzęku, obliczone dla wszystkich badanych zwierząt wynosi 2 lub więcej; lub

b) w przypadku gdy badanie z załącznika V zostało wykonane, wykorzystując trzy zwierzęta, zarówno powstanie rumieńca i strupów lub utworzenie obrzęku zostało obliczone oddzielnie u dwu lub więcej zwierząt jako równoważne średniej wartości punktowej co najmniej 2.

W obu przypadkach do obliczenia wartości średniej należy wykorzystać wszystkie oceny punktowe danego skutku, odczytane w każdym punkcie czasowym (24, 48 i 72 godziny).

Stan zapalny skóry jest także wyraźny, jeśli powstaje u co najmniej dwóch zwierząt pod koniec czasu obserwacji. Poszczególne skutki, na przykład hyperplazja, łuszczenie, odbarwianie, pęknięcia, świerzb i alopecia powinny być uwzględnione.

Stosowne dane mogą być także dostępne z nieostrych badań na zwierzętach (patrz uwagi dotyczące R48, pkt 2.d). Mogą być one uznane za znaczące, jeśli skutki wydają się być porównywalne do opisanych powyżej.

- Substancje i preparaty, które powodują wyraźny stan zapalny na skórze, w oparciu praktycznych obserwacji u ludzi w kontakcie bezpośrednim, przedłużonym i powtarzanym.

- Organiczne nadtlenki, poza tymi gdzie dostępne dowody są sprzeczne.

Parestezja:

Parestezja spowodowana u ludzi poprzez kontakt skóry z pestycydami pyretroidowymi nie dotyczy drażniącego skutku uzasadniającego klasyfikację jako Xi; R38. Należy jednak zastosować oznaczenie S24 do substancji uznanych za mogące powodować taki skutek.

3.2.6.2. Uszkodzenia oka

Następujące wyrażenia oznaczające zagrożenie są przypisane zgodnie z danymi kryteriami:

R36 Działa drażniąco na oczy

- Substancje i preparaty, które zaaplikowane do oka zwierzęcia powodują powstanie wyraźnych uszkodzeń, powstających w czasie obejmującym 72 godziny po ekspozycji i utrzymują się co najmniej 24 godziny.

Uszkodzenia oka są wyraźne, jeśli średnia punktacja badania podrażnienia oka, cytowana w załączniku V, odpowiada jakiejkolwiek z następujących wartości:

- zmętnienie rogówki równa lub większe od 2 lecz mniejsza od 3,

- uszkodzenie tęczówki równa lub większa od 1 lecz nie większa od 1,5,

- przekrwienie spojówek równe lub większe od 2,5,

- obrzęk spojówki (chemosis) równa lub większa od 2,

lub w przypadku wykonania badania z załącznika V z wykorzystaniem trzech zwierząt, jeśli uszkodzenia oczu u dwóch lub więcej zwierząt odpowiadają jednej z podanych powyżej wartości, z wyjątkiem uszkodzenia tęczówki, gdzie wartość powinna być równa lub większa od 1, ale mniejsza od 2 i dla przekrwienia spojówki, gdzie wartość powinna być równa lub większa od 2,5.

W obu przypadkach wszystkie oceny punktowe w każdym z czasów odczytu (24, 48 i 72 godziny) dla każdego skutku muszą być użyte w obliczeniu poszczególnych wartości średnich.

- Substancje lub preparaty, które powodują wyraźne uszkodzenia oczu, z praktycznych obserwacji ludzi.

- Organiczne nadtlenki, poza tymi gdzie dostępne dowody są sprzeczne.

R41 Zagrożenie poważnego uszkodzenia oczu

- Substancje lub preparaty, które podane do oka zwierzęcia powodują powstawanie poważnych uszkodzeń oczu w ciągu 72 godzin od momentu ekspozycji i utrzymujących się przez co najmniej 24 godziny.

Uszkodzenia oka są uznawane za poważne, jeśli średnie oceny punktowe badania podrażnienia oka z załącznika V mają jedną z wartości:

- zmętnienie rogówki równe lub większe od 3,

- uszkodzenie tęczówki większe niż 1,5.

To samo dotyczy przypadku, gdy przeprowadzono badania na trzech zwierzętach, jeżeli uszkodzenia na dwóch lub więcej zwierzętach mają jedną z wartości:

- zmętnienie rogówki równe lub większe od 3,

- uszkodzenie tęczówki równe 2.

W obu przypadkach wszystkie oceny punktowe w każdym z czasów odczytu (24, 48 i 72 godziny) dla każdego skutku powinny być użyte w obliczeniu odpowiednich wartości średnich.

Uszkodzenia oka są uznawane także za poważne, gdy występują jeszcze pod koniec czasu obserwacji.

Uszkodzenia oka są uznawane za poważne, jeśli substancje lub preparaty powodują nieodwracalne zabarwienie oczu.

- Substancje lub preparaty, które powodują poważne uszkodzenia oczu, na podstawie praktycznych obserwacji u ludzi.

Uwaga:

Gdy substancja lub preparat jest sklasyfikowana jako żrąca i przypisano jej R34 lub R35, zagrożenie poważnego uszkodzenia oczu jest oczywiste, a R41 nie jest zawarty w etykiecie.

3.2.6.3. Podrażnianie układu oddechowego

Następujące wyrażenie oznaczające zagrożenie jest przypisane zgodnie z danymi kryteriami:

R37 Działa drażniąco na układ oddechowy

Substancje i preparaty, które powodują poważne podrażnienie układu oddechowego, oparte na:

- praktycznych obserwacjach u ludzi,

- pozytywnych wynikach z właściwych badań na zwierzętach.

Uwagi odnoszące się do użycia R37:

Przy interpretacji praktycznych obserwacji u ludzi należy zachować ostrożność w rozróżnianiu między skutkami, które prowadzą do sklasyfikowania jako R48 (patrz ppkt 3.2.4) od tych prowadzących do sklasyfikowania jako R37. Warunki zwykle prowadzące do klasyfikacji jako R37 są odwracalne i zwykle ograniczone do górnych dróg oddechowych.

Pozytywne wyniki z właściwych badań na zwierzętach mogą obejmować dane uzyskane w badaniu ogólnej toksyczności, łącznie z danymi histopatologicznymi z systemu oddechowego. Dane z pomiarów doświadczalnych bradypnea mogą być również używane do oceny podrażnienia dróg oddechowych.

3.2.7. Uczulające

3.2.7.1. Uczulenie poprzez wdychanie

Substancje i preparaty są sklasyfikowane jako uczulające i przypisuje im się symbol "Xn" i oznaczenie niebezpieczeństwa "szkodliwy" oraz wyrażenie oznaczające zagrożenie R42 zgodnie z kryteriami podanymi poniżej.

R42 Może powodować uczulenie przy wdychaniu

- jeśli istnieje dowód, że substancja lub preparat może wywołać specyficzną oddechową nadwrażliwość,

- w pozytywnych wynikach właściwych badań wykonanych na zwierzętach, lub

- jeżeli substancja jest izocyjanianem, chyba że jest dowód, że określony izocyjanian nie powoduje oddechowej nadwrażliwości.

Uwagi odnoszące się do użycia R42:

Oznaki u ludzi

Dowód, że substancja lub preparat może indukować określoną nadwrażliwość oddechową jest zwykle oparty na ludzkim doświadczeniu. W tym kontekście nadwrażliwość zwykle jest astmą, ale również są rozważane inne reakcje nadwrażliwości, takie jak nieżyt nosa lub zapalenie pęcherzyków płucnych. Warunkiem musi być kliniczny charakter reakcji alergicznej. Jednakże nie można przedstawić mechanizmu immunologicznego.

Przy rozważaniu oznak ekspozycji ludzi na działanie substancji konieczne jest przy decyzji dotyczącej klasyfikacji uwzględnienie ponadto dowodów dotyczących kwestii:

- ilość ludzi wystawionych na działanie substancji,

- zakres ekspozycji na działanie substancji.

Oznakami określonymi powyżej mogą być:

- historia kliniczna oraz dane z właściwych badań płucnych związanych z ekspozycją na substancję, potwierdzoną innymi dowodami wspierającymi, które mogą obejmować:

- strukturę chemiczną związaną ze substancjami znanymi z powodowania nadwrażliwości oddechowej,

- próbę odpornościową in vivo (np. badanie nakłuwania skóry),

- próbę odpornościową in vitro (np. analiza serologiczna),

- badania wykazujące inne szczególne, lecz nieimmunologiczne mechanizmy działania, np. powtarzalny niski poziom podrażnienia, pośrednie działania farmakologiczne, lub

- dane z pozytywnej próby oskrzelowej z substancją wprowadzoną zgodnie z przyjętymi wytycznymi dotyczącymi określenia szczególnej reakcji nadwrażliwości.

Historia kliniczna powinna obejmować zarówno medyczną, jak i zawodową historię, aby ustalić zależność między ekspozycją na działanie określonej substancji lub preparatu oraz rozwój nadwrażliwości oddechowej. Odpowiednie informacje zawierają pogarszające czynniki zarówno w domu, jak i w miejscu pracy, początek i postęp choroby, historię rodziny i danego pacjenta. Historia medyczna powinna także zawierać uwagi o innych nieprawidłowościach alergicznych lub układu oddechowego od dzieciństwa, oraz historie palenia.

Wyniki pozytywnych badań oskrzelowych są rozważane, aby dostarczyć dostatecznego dowodu dla klasyfikacji na własny użytek. Jest jednakże powszechnie wiadome, że w praktyce wiele badań zamieszczonych powyżej było już przeprowadzonych.

Substancje, które ujawniają symptomy astmy przez podrażnienie tylko u ludzi z nadaktywnością oskrzelową nie mogą być oznaczane R42.

Badania na zwierzętach

Dane z badań, które mogą wskazywać potencjał substancji lub preparatu w powodowaniu uczulenia przez inhalację u ludzi, zawierają:

- pomiary IgE (np. u myszy) lub

- specyficzne reakcje płucne u świnek morskich.

3.2.7.2. Uczulenie przez kontakt ze skórą

Substancje i preparaty są sklasyfikowane jako uczulające i oznaczone symbolem "Xi" i oznaczeniem "drażniąca" oraz wyrażeniem oznaczającym zagrożenie R43 zgodnie z kryteriami podanymi poniżej.

R43 Może powodować uczulenie przez kontakt ze skórą

- jeśli praktyczne doświadczenie wskazuje, że substancja lub preparat jest zdolny do powodowania uczulenia przez kontakt ze skórą u znacznej liczby osób, lub

- w przypadku pozytywnych wyników z właściwych badań na zwierzętach.

Uwagi odnoszące się do użycia R43:

Oznaki u ludzi

Następujące oznaki (doświadczenie praktyczne) są wystarczające do klasyfikowania substancji lub preparatu jako R43:

- pozytywne dane z właściwych badań śladów, zwykle w więcej niż jednej klinice dermatologicznej, lub

- epidemiologiczne badania wskazujące alergiczne kontaktowe zapalenie skóry spowodowane przez substancję lub preparat. Sytuacje, w których wysoka proporcja tych eksponowanych wykazuje charakterystyczne symptomy mają być obejrzane z dużą uwagą nawet, jeśli liczba przypadków jest mała, lub

- pozytywne dane z doświadczalnych badań u ludzi (patrz także ppkt 3.1.1).

Następujące kryteria są wystarczające do klasyfikowania substancji za pomocą R43, gdy istnieją wspierające oznaki:

- wydzielone epizody alergicznego kontaktowego zapalenia skóry, lub

- badania epidemiologiczne, w sytuacji gdy przypadek, błąd systematyczny lub wprowadzenia w błąd nie są z uzasadnioną wiarygodnością w pełni wykluczone.

Dowody wspierające mogą obejmować:

- dane z badań na zwierzętach wykonanych zgodnie z istniejącymi wytycznymi, z wynikiem niespełniającym kryteriów podanych w podpunkcie o badaniach na zwierzętach, lecz będącym wystarczająco blisko granicy, aby zostać rozważony jako znaczący, lub

- dane z metod niestandardowych, lub

- właściwe zależności struktura-działanie.

Badania na zwierzętach

Pozytywnymi wynikami właściwych badań na zwierzętach są:

- w przypadku metody badanej typu pomocniczego dla uczulenia skórnego opisanego szczegółowo w załączniku V lub w przypadku innych pomocniczego typu metod badania, o reakcji co najmniej u 30% zwierząt jest uznany za pozytywny,

- w odniesieniu do jakiejkolwiek innej metody badania o reakcji u co najmniej 15% zwierząt jest uznany za pozytywny.

3.2.7.3. Immunologiczna kontaktowa pokrzywka

Niektóre substancje lub preparaty, które spełniają kryteria dla R42, powodują dodatkowo immunologiczną pokrzywkę kontaktową. W tych przypadkach informacje dotyczące pokrzywki kontaktowej powinny być włączone poprzez użycie właściwych oznaczeń S, zwykle S24 i S36/37 oraz w arkuszu danych dotyczących bezpieczeństwa.

W odniesieniu do substancji lub preparatów wytwarzających oznaki immunologicznej kontaktowej pokrzywki, które nie spełniają kryteriów dla R42, należy rozważyć klasyfikację za pomocą R43.

Nie istnieje uznany model zwierzęcia dostępny do zidentyfikowania substancji, które powodują immunologiczną pokrzywkę kontaktową. Dlatego klasyfikacja zwykle jest oparta na dowodach u ludzi, które są podobne dla uczulających skórę (R43).

3.2.8. Inne właściwości toksykologiczne

Dodatkowe wyrażenia oznaczające zagrożenie są przypisane zgodnie z następującymi kryteriami (oparte na doświadczeniu uzyskanym w trakcie zestawiania załącznika I) dla substancji i preparatów sklasyfikowanych na mocy ppkt 2.2.1-3.2.7 i/lub pkt 4 i 5:

R29 Kontakt z wodą wyzwala toksyczny gaz

W odniesieniu do substancji i preparatów, które w kontakcie z wodą lub wilgotnym powietrzem wydzielają bardzo toksyczne/toksyczne gazy w ilościach potencjalnie niebezpiecznych, np. fosforek glinu, pięciosiarczek fosforu.

R31 Kontakcie z kwasami uwalnia toksyczny gaz

W odniesieniu do substancji i preparatów, które reagując z kwasami uwalniają toksyczne gazy w ilościach niebezpiecznych, np. podchloryn sodu, polisiarczek baru. W odniesieniu do substancji stosowanych przez ogół społeczeństwa użycie S50 (nie mieszać z ... (ma być określone przez producenta)) jest bardziej odpowiednie.

R32 Kontak z kwasami uwalnia bardzo toksyczny gaz

W odniesieniu do substancji i preparatów, które reagując z kwasami uwalniają bardzo toksyczne gazy w niebezpiecznych ilościach, np. sole cyjanowodoru, azydek sodowy. W odniesieniu do substancji używanych przez ogół społeczeństwa, użycie S50 (nie mieszać z .... (ma być określone przez producenta)) jest bardziej odpowiednie.

R33 Niebezpieczeństwo skutków kumulacyjnych

W odniesieniu do substancji i preparatów, gdy kumulacja w ciele ludzkim jest prawdopodobna i powoduje pewne uszkodzenia, które jednak nie są wystarczające do usprawiedliwienia użycia R48.

W odniesieniu do uwag dotyczących użycia niniejszego oznaczenia R patrz ppkt 4.2.3.3 w zakresie substancji i część A.3 załącznika V do dyrektywy 1999/45/WE w zakresie preparatów.

R64 Może działać szkodliwie na dzieci karmione piersią

W odniesieniu do substancji i preparatów, które są absorbowane przez kobiety i mogą zakłócać laktację lub które mogą być obecne (zawierając metabolity) w mleku w ilościach dostatecznych, aby dać powody do obaw o zdrowie karmionego dziecka.

Jeśli chodzi o uwagi w sprawie użycia niniejszego wyrażenia "R" patrz ppkt 4.2.3.3 w zakresie substancji i część A.4 załącznika V do dyrektywy 1999/45/WE w zakresie preparatów.

R66 Powtarzające się ekspozycje na działanie substancji mogą powodować suchość i pękanie skóry

W odniesieniu do substancji i preparatów, które powodują uszkodzenia w wyniku wysuszenia skóry, łuszczenie i pękanie skóry, lecz nie spełniają kryteriów dla R38 opartych na:

- praktycznej obserwacji po zwykłym stosowaniu i użyciu, albo

- odpowiednich dowodów dotyczących ich przewidywanych skutków na skórze.

Patrz także ppkt 1.6 i 1.7.

R67 Opary mogą powodować senność i oszołomienie

W odniesieniu do lotnych substancji i preparatów zawierających takie substancje, które powodują wyraźne symptomy depresji centralnego systemu nerwowego poprzez wdychanie i które nie są już sklasyfikowane odnośnie do ostrej toksyczności przez wdychanie (R20, R23, R26, R68/20, R39/23 lub R39/26).

Mogą być wykorzystane następujące dowody:

a) dane z badań na zwierzętach wykazujące wyraźne oznaki depresji CNS, takie jak skutki narkotyczne, letargię, brak koordynacji (włączając brak lub prawidłowy refleks) i ataksję, albo:

- przy czasie stężenia/ekspozycji na działanie substancji nieprzekraczającym 20 mg/l/4h, lub

- dla których stosunek wpływu stężenia przy ≤ 4h do stężenia pary nasyconej (SVC) w 20° C jest ≤ 1/10;

b) praktyczne doświadczenia u ludzi (np. narkoza, senność, zmniejszona czujność, brak refleksu, brak koordynacji, zawroty głowy) z dobrze udokumentowanych sprawozdań dla porównywalnych warunków ekspozycji do skutków określonych powyżej, dla zwierząt.

Patrz także ppkt 1.6 i 1.7.

W odniesieniu do uzupełniających wyrażeń oznaczających zagrożenie patrz ppkt 2.2.6.

4. KLASYFIKACJA NA PODSTAWIE SZCZEGÓLNEGO WPŁYWU NA ZDROWIE CZŁOWIEKA

4.1. Wprowadzenie

4.1.1. Niniejszy rozdział określa procedurę klasyfikacji substancji, które mają skutki wspomniane poniżej. W odniesieniu do preparatów patrz ppkt 4.2.4.

4.1.2. Jeżeli producent, dystrybutor lub importer posiada dostępne informacje, które wskazują, że substancja powinna być sklasyfikowana i etykietowana zgodnie z kryteriami podanymi w ppkt 4.2.1, 4.2.2 lub 4.2.3, etykietuje on tymczasowo substancje zgodnie z kryteriami, na podstawie oceny dowodów przez kompetentną osobę.

4.1.3. Producent, dystrybutor lub importer składa, tak szybko jak to możliwe, dokument zestawiający wszystkie istotne informacje dla jednego Państwa Członkowskiego, w którym substancja jest wprowadzona do obrotu. Istotne informacje w tym kontekście obejmują w szczególności wszystkie dostępne publikowane i niepublikowane informacje wymagane dla właściwej klasyfikacji danej substancji, na podstawie wewnętrznych właściwości zgodnie z kategoriami ustanowionymi w art. 2 ust. 2 i zgodnie z kryteriami w niniejszym załączniku. Złożony dokument zestawiający powinien zawierać bibliografię zawierającą wszystkie stosowne odniesienia, łącznie z wszystkimi stosownymi niepublikowanymi danymi.

4.1.4. Ponadto producent, dystrybutor lub importer, który posiada nowe dane, które są istotne dla klasyfikacji i etykietowania substancji zgodnie z kryteriami podanymi w ppkt 4.2.1, 4.2.2 lub 4.2.3 przekazuje te dane, tak szybko jak to możliwe, Państwu Członkowskiemu, w którym substancja jest wprowadzona do obrotu.

4.1.5. W celu osiągnięcia tak szybko jak to możliwe zharmonizowanej klasyfikacji dla Wspólnoty poprzez procedurę określoną w art. 28 niniejszej dyrektywy Państwa Członkowskie, które posiadają dostępne istotne informacje uzasadniające klasyfikację substancji w jednej z tych kategorii, czy podanej przez producenta czy nie, powinny przesłać Komisji takie informacje wraz z sugestiami dotyczącymi klasyfikacji i etykietowania, tak szybko jak to możliwe.

Komisja przesyła do innych Państw Członkowskich propozycję klasyfikacji i etykietowania, które otrzyma. Każde Państwo Członkowskie może zwrócić się do Komisji o informacje, które Komisja otrzymała.

Każde Państwo Członkowskie mające dobre podstawy, aby przypuszczać, że sugerowana klasyfikacja i etykietowanie są niewłaściwe w zakresie, w jakim dotyczy to toksycznych skutków rakotwórczych, mutagennych lub rozrodczych, zgłasza to Komisji.

4.2. Kryteria dotyczące klasyfikacji, oznaczenia niebezpieczeństwa, wyboru wyrażenia oznaczające zagrożenie

4.2.1. Substancje rakotwórcze

Do celów klasyfikacji i etykietowania oraz uwzględniając bieżący stan wiedzy, takie substancje podzielono na trzy kategorie:

Kategoria 1

Substancje znane jako rakotwórcze dla człowieka. Istnieją wystarczające dowody wskazujące na związek przyczynowy między ekspozycją człowieka na tę substancję a powstawaniem raka.

Kategoria 2

Substancje, które powinny być uznane za rakotwórcze dla człowieka. Istnieją wystarczające dowody pozwalające na silne domniemanie, że ekspozycja człowieka na te substancje powoduje powstawanie raka ogólnie na podstawie:

- właściwych długoterminowych badaniach na zwierzętach,

- innych istotnych informacji.

Kategoria 3

Substancje, które mogą powodować dotyczące człowieka odpowiednie efekty rakotwórcze, lecz w odniesieniu do których dostępne informacje nie są wystarczające do dokonania zadawalającej oceny. Istnieją pewne dowody z odpowiednich badań na zwierzętach, ale są niewystarczające, by umieścić te substancje w kategorii 2.

4.2.1.1. Stosuje się następujące symbole i określone wyrażenia oznaczające zagrożenie:

Kategorie 1 i 2

Substancje sklasyfikowane kategoriami rakotwórczymi 1 lub 2 są oznaczone symbolem "T" i wyrażeniem oznaczającym zagrożenie.

R45 Może być przyczyną raka

Jednakże substancje i preparaty, które stanowią zagrożenie rakotwórcze jedynie wtedy, gdy są wdychane, na przykład jako pył, pary lub dymy (inne drogi ekspozycji, np. przez spożycie lub w kontakcie ze skórą nie przedstawiają jakiegokolwiek zagrożenia rakotwórczego), są oznaczone symbolem "T" i wyrażeniem oznaczającym zagrożenie.

R49 Może być przyczyną raka przez wdychanie

Kategorie 3:

Substancje sklasyfikowane jako rakotwórcze kategorii 3 są oznaczone symbolem "Xn" i wyrażeniem oznaczającym zagrożenie

R40 Ograniczone oznaki działania rakotwórczego

4.2.1.2. Uwagi odnoszące się do ustalania kategorii substancji rakotwórczych

Umieszczenie substancji w kategorii 1 przeprowadza się na podstawie danych epidemiologicznych; umieszczenie w kategoriach 1 i 2 jest oparte przede wszystkim na doświadczeniach na zwierzętach.

Dla klasyfikacji substancji jako kategoria 2 rakotwórcza powinny być dostępne pozytywne wyniki na dwóch gatunkach zwierząt albo wyraźne pozytywne dowody na jednym gatunku, wraz z dowodami na poparcie, takimi jak dane genotoksyczne, badania metaboliczne lub biochemiczne, wywoływanie łagodnych nowotworów, strukturalne pokrewieństwo z innymi znanymi kancerogenami lub dane z badań epidemiologicznych sugerujące związek.

Kategoria 3 faktycznie obejmuje 2 podkategorie:

a) substancje, które są dobrze zbadane, lecz dla których dowody indukowania nowotworu są niewystarczające do sklasyfikowania w kategorii 2. Po dodatkowych doświadczeniach nie należy oczekiwać dostarczenia dalszych istotnych informacji odnoszących się do klasyfikacji;

b) substancje, które są niedostatecznie zbadane. Dostępne dane są nieodpowiednie, ale wzbudzają niepokój o człowieka. Niniejsza klasyfikacja jest tymczasowa; niezbędne są dalsze doświadczenia przed podjęciem końcowej decyzji.

Dla odróżnienia między kategoriami 2 i 3 argumenty podane poniżej są stosowne do zmniejszenia znaczenia doświadczalnej indukcji nowotworu z punktu prawdopodobnej ekspozycji człowieka. Te argumenty, szczególnie w połączeniu mogą prowadzić w większości przypadków do klasyfikacji do kategorii 3, nawet gdyby nowotwory wywołano u zwierząt:

- działanie rakotwórcze tylko na bardzo wysokim poziomie dawki, przekraczającej "maksymalną dawkę tolerowaną". Maksymalna dawka tolerowana jest scharakteryzowana przez działanie toksyczne, które chociaż jeszcze nie zmniejsza długości życia, powoduje zmiany fizyczne jak około 10% zmniejszenie przyrostu wagi,

- pojawianie się nowotworów, szczególnie przy wysokich poziomach dawki, tylko w poszczególnych organach niektórych gatunków zwierząt, znanych z dużej samorzutnej zdolności tworzenia nowotworów,

- pojawianie się nowotworów, tylko w miejscu aplikacji, w bardzo czułych systemach badanych (np. aplikacja i.p. lub s.c niektórych miejscowo aktywnych związków), jeśli to szczególne miejsce nie jest istotne dla człowieka,

- brak genotoksyczności w krótkoterminowych badaniach in vivo i in vitro,

- istnienie wtórnych mechanizmów działania z implikacją praktycznego progu powyżej pewnego poziomu dawki (np. hormonalne działania na docelowe organy lub na mechanizmy regulacji fizjologicznych, przewlekła stymulacja proliferacji komórek),

- istnienie szczególnego dla gatunku mechanizmu tworzenia nowotworu (np. przez specyficzne ścieżki metaboliczne), nieistotnego dla człowieka.

Dla rozróżnienia między kategorią 3 i niesklasyfikowania istotne są argumenty, które wyłączają ich znaczenie dla człowieka:

- substancja nie powinna być sklasyfikowana w jakiejkolwiek kategorii, jeśli mechanizm doświadczalnego tworzenia nowotworu jest wyraźnie określony, z dobrymi dowodami, że ten proces nie może być ekstrapolowany na człowieka,

- jeśli jedynymi dostępnymi danymi nowotworowymi są nowotwory wątroby u niektórych wrażliwych szczepów myszy, bez jakichkolwiek dodatkowych dowodów, substancja nie może być sklasyfikowana w jakiejkolwiek z kategorii,

- należy zwrócić szczególną uwagę na przypadki, gdzie jedyne dostępne dane dotyczące nowotworu to dane o pojawieniu się guzów w miejscach i u szczepów, które są dobrze znane, z tworzenia się samorzutnie z wysoką częstością.

4.2.2. Substancje mutagenne

4.2.2.1. Do celów klasyfikacji i etykietowania oraz uwzględniając aktualny stan wiedzy, substancje te podzielono na trzy kategorie:

Kategoria 1

Substancje o znanym działaniu mutagennym na człowieka.

Istnieją wystarczające dowody wskazujące na związek przyczynowy między ekspozycją człowieka i dziedzicznymi uszkodzeniami genetycznymi.

Kategoria 2

Substancje, które powinny być uznane za mutagenne dla człowieka.

Istnieją wystarczające dowody stanowiące silne domniemanie, że ekspozycja człowieka na substancję powoduje powstawanie uszkodzeń genetycznie dziedzicznych, ogólnie na podstawie:

- odpowiednich badań na zwierzętach,

- innych istotnych informacjach.

Kategoria 3

Substancje, które mogą powodować możliwe działanie mutagenne dla człowieka. Istnieją dowody z właściwych badań mutagennych, ale są niewystarczające do umieszczenia substancji w kategorii 2.

4.2.2.2. Stosuje się następujące symbole i szczególne wyrażenia oznaczające zagrożenie:

Kategorie 1 i 2:

Substancje sklasyfikowane jako mutagenne kategorii 1 lub 2 są oznaczone symbolem "T" i wyrażeniem oznaczającym zagrożenie.

R46 Może powodować dziedziczne uszkodzenia genetyczne

Kategoria 3:

Substancje sklasyfikowane jako mutagenne kategorii 3 są oznaczone symbolem "Xn" i wyrażeniem oznaczającym zagrożenie.

R68 Możliwe zagrożenie nieodwracalnych skutków.

4.2.2.3. Uwagi odnoszące się do ustalania kategorii substancji mutagennych

Definicje pojęć:

Mutacja jest trwałą zmianą w ilości lub strukturze materiału genetycznego w organizmie, powodującą zmiany charakterystyki fenotypowej organizmu. Zmiany dotyczą pojedynczego genu, zespołów genów lub całego chromosomu. Działania na pojedyncze geny są konsekwencją działania na pojedyncze zasady DNA (punktowe mutacje) lub dużych zmian, włączając delację wewnątrz genu. Działania na całe chromosomy powodują zmiany strukturalne lub liczbowe. Mutacja w komórkach rozrodczych w płciowo rozmnażających się organizmach jest przekazywana na potomstwo. Mutagen jest środkiem, który zwiększa możliwość zdarzenia się mutacji.

Należy zauważyć, że substancje są sklasyfikowane jako mutagenne ze szczególnym odniesieniem do dziedzicznych uszkodzeń genetycznych. Jednakże typ wyników prowadzących do klasyfikacji substancji chemicznych w kategorii 3: "indukcja genetycznie istotnych przypadków w komórkach somatycznych" jest ogólnie rozpatrywany jako alarm dla możliwego działania rakotwórczego.

Rozwój metod badania mutagenności jest stałym procesem. Dla wielu nowych badań nie ma obecnie dostępnych protokołów standaryzowanych kryteriów oceny. Dla oceny danych mutagenności należy rozważyć jakość prowadzonych badań i stopień wiarygodności metody badania.

Kategoria 1

Aby umieścić substancję w kategorii 1, wymagane są pozytywne dowody z epidemiologicznych badań mutacji u ludzi. Przykłady takich substancji nie są znane do tej pory. Wiadomo, że niezwykle trudno jest uzyskać wiarygodne informacje z badań dotyczących częstości mutacji w populacji ludzkiej lub dotyczących możliwego wzrostu ich częstości.

Kategoria 2

Aby umieścić substancję w kategorii 2, są wymagane pozytywne wyniki z testów wskazujących: a) działania mutagenne, lub b) inne interakcje komórkowe istotne dla mutagenności, w komórkach rozrodczych ssaków in vivo, lub c) skutki mutagenne w komórkach somatycznych ssaków in vivo w połączeniu z wyraźnymi dowodami, że substancja lub stosowny metabolit osiąga komórkę rozrodczą.

Obecnie w odniesieniu do umieszczenia substancji w kategorii 2 właściwe są następujące metody:

2a) Próby in vivo mutagenności komórek rozrodczych:

- badanie mutacji określonego locus,

- badanie wrodzonej translokacji genowej,

- badanie dominującej mutacji letalnej.

Te badania rzeczywiście pokazują pojawianie się oddziaływania na potomstwo lub defekty w rozwoju embrionu.

2b) Próby in vivo wskazujące istotne interakcje z komórkami rozrodczymi (zwykle z DNA):

- próby dotyczące nieprawidłowości chromosomowych, jak wykryto w analizie cytogenetycznej, włączając aneuplodię, powodowaną przez złą segregację chromosomów,

- badanie wymiany siostrzanych chromatyd (SCEs),

- badanie nieplanowanej syntezy DNA (UDS),

- próba (kowalencyjnego) wiązania mutagenu z komórką rozrodczą DNA,

- testowanie innych rodzajów uszkodzeń DNA.

Próby te dostarczają dowodów bardziej lub mniej pośredniego charakteru. Pozytywne wyniki tych testów powinny być zwykle wsparte przez pozytywne wyniki z badań in vivo mutagennych komórek somatycznych, u ssaków lub u ludzi (patrz kategoria 3, zalecane metody jak w pkt 3 lit. a)).

2c) Próby in vivo wskazują mutagenne skutki w komórkach somatycznych ssaków (patrz pkt 3 lit. a)), w połączeniu z metodami toksykokinetycznymi, lub innymi metodologiami zdolnymi do wskazania, że związek lub stosowny metabolit osiąga komórki rozrodcze.

Dla pkt 2 lit. b) i pkt 2 lit. c), pozytywne wyniki prób z gospodarzem lub pokazanie niedwuznacznych skutków w próbach in vitro jest uznawane za dowód wspierający.

Kategoria 3

Dla umieszczenia substancji w kategorii 3 konieczne są pozytywne wyniki z prób wskazujących: a) działanie mutagenne lub b) inne komórkowe interakcje istotne dla mutagenności w komórkach somatycznych u ssaków in vivo. To ostatnie w szczególności powinno zwykle być wsparte pozytywnymi wynikami z prób mutagenności in vitro.

Obecnie dla skutków w komórkach somatycznych in vivo właściwe są następujące metody:

3a) Próby in vivo mutagenności komórek somatycznych:

- badanie mikrojądrowy komórek szpiku kostnego lub analiza metafazy,

- analiza metafazy w limfocytach obwodowych,

- badanie barwnych plam na sierści myszy.

3b) Próby in vivo interakcji DNA w komórkach somatycznych DNA:

- badanie SCEs w komórkach somatycznych,

- badanie UDS w komórkach somatycznych,

- próba kowalencyjnego wiązania mutagenu z komórką somatyczną DNA,

- test uszkodzenia DNA, np. za pomocą elucji alkalicznej w komórkach somatycznych.

Substancje wykazujące pozytywne wyniki tylko w jednym lub więcej testach mutagenności in vitro zwykle nie powinno się klasyfikować. Ich dalsza obserwacja, stosując testy in vivo, jest mocno wskazana. W wyjątkowych sytuacjach, np. dla substancji wykazującej wyraźną reakcję w kilku testach in vitro, w odniesieniu do której nie są dostępne właściwe dane in vivo i która wykazuje podobieństwo do znanych mutagenów/kancerogenów, można rozważyć klasyfikację do kategorii 3.

4.2.3. Substancje toksyczne dla rozrodczości

4.2.3.1. W celach klasyfikacji i etykietowania oraz uwzględniając aktualny stan wiedzy, substancje te podzielono na trzy kategorie:

Kategoria 1

Substancje osłabiające rozrodczość u ludzi

Istnieją wystarczające dowody wskazujące na związek przyczynowy między oddziaływaniem substancji na człowieka i osłabioną rozrodczością.

Substancje wywyłujące toksyczność rozwojową u ludzi

Istnieją wystarczające dowody wskazujące na związek przyczynowy między oddziaływaniem substancji na człowieka i następującymi skutkami toksyczności rozwojowej u potomstwa.

Kategoria 2

Substancje, które powinny być rozpatrywane jako osłabiające rozrodczość u ludzi

Istnieją wystarczające dowody stanowiące silne domniemanie, że oddziaływanie substancji na człowieka może osłabiać rozrodczość na podstawie:

- wyraźnych dowodów z badań na zwierzętach osłabionej rozrodczości, przy braku skutków toksycznych lub dowodów, że osłabienie rozrodczości występuje przy około takich samych poziomach dawkowania, jak inne toksyczne skutki, lecz które nie są wtórną nieokreśloną konsekwencją innych skutków toksycznych,

- inne istotne informacje.

Substancje, które powinny być uznane za wywołujące toksyczność rozwojową u ludzi

Istnieją wystarczające dowody stanowiące silne domniemanie, że odziaływanie substancji na człowieka może powodować toksyczność rozwojową potomstwa, ogólnie na podstawie:

- wyraźnych wyników z właściwych badań na zwierzętach w przypadku, gdy obserwowano działania przy nieobecności oznak znaczącej toksyczności u matek lub przy około takich samych poziomach dawkowania, jak inne toksyczne skutki, lecz które nie są wtórną nieokreśloną konsekwencją innych skutków toksycznych,

- inne istotne informacje.

Kategoria 3

Substancje, które powodują obawy dotyczące ludzkiej rozrodczości

Ogólnie na podstawie:

- wyników właściwych badań na zwierzętach, które dostarczają wystarczających dowodów, aby wzbudzić mocne podejrzenie osłabienia rozrodczości, przy braku toksycznych skutków lub dowodów osłabienia rozrodczości przy około takich samych poziomach dawkowania, jak inne toksyczne skutki, lecz które nie są wtórną nieokreśloną konsekwencją innych skutków toksycznych, gdy dowody te nie są wystarczające na umieszczenie substancji w kategorii 2,

- inne istotne informacje.

Substancje, które powodują obawy u ludzi wynikające z możliwych skutków toksyczności rozwojowej

Ogólnie na podstawie:

- wyników właściwych badań na zwierzętach, które dostarczają wystarczających dowodów, aby wzbudzić mocne podejrzenie toksyczności rozwojowej potomstwa, przy braku znaków znaczącej toksyczności u matek lub przy około takich samych poziomach dawkowania, jak inne toksyczne skutki, lecz które nie są wtórną nieokreśloną konsekwencją innych skutków toksycznych, gdy dowody te nie są wystarczające na umieszczenie substancji w kategorii 2,

- inne istotne informacje.

4.2.3.2. Stosuje się następujące symbole i szczególne wyrażenia oznaczające zagrożenie:

Kategoria 1:

dla substancji osłabiających rozrodczość u ludzi:

Substancje sklasyfikowane jako toksyczne dla rozrodczości kategorii 1, są oznaczone symbolem "T" i wyrażeniem oznaczającym zagrożenie

R60 Może osłabiać płodność

dla substancji powodujących toksyczność rozwojową:

Substancje sklasyfikowane jako toksyczne dla rozrodczości kategorii 1 są oznaczone symbolem "T" i wyrażeniem oznaczającym zaagrożenie

R61 Może działać szkodliwie na nienarodzone dziecko

Kategoria 2:

dla substancji, które powinny być uznane za osłabiające rozrodczość u ludzi:

Substancje sklasyfikowane jako toksyczne dla rozrodczości kategorii 2 są oznaczone symbolem "T" i wyrażeniem oznaczającym zagrożenie

R60 Może osłabiać płodność

dla substancji, które powinny być uznane za powodujące toksyczne działania na rozwój potomstwa człowieka:

Substancje sklasyfikowane jako toksyczne dla rozrodczości kategorii 2 są oznaczone symbolem "T" i wyrażeniem oznaczającym zagrożenie

R61 Może działać szkodliwie na nienarodzony płód

Kategoria 3:

dla substancji, które wywołują obawy dotyczące ludzkiej rozrodczości:

Substancje sklasyfikowane jako toksyczne dla rozrodczości kategorii 3, są oznaczone symbolem "Xn" i wyrażeniem oznaczającym zagrożenie

R62 Możliwe ryzyko upośledzenia płodności

dla substancji, które powodują obawy dotyczące wynikających dla człowieka możliwych toksycznych skutków na rozwój płodu:

Substancje sklasyfikowane jako toksyczne dla rozrodczości kategorii 3 są oznaczone symbolem "Xn" i wyrażeniem oznaczającym zagrożenie

R63 Możliwe zagrożenie uszkodzenia nienarodzonego dziecka.

4.2.3.3. Uwagi odnoszące się do ustalania kategorii substancji toksycznych dla rozrodczości

Toksyczność dla rozrodczości obejmuje zmniejszenie funkcji rozrodczych samców i samic lub zdolności indukcji niedziedzicznych szkodliwych skutków u potomstwa. Może to być sklasyfikowane pod dwoma głównymi pozycjami 1. Wpływ na rozrodczość u samców i samic, 2. Toksyczność rozwojowa.

1 Wpływ na rozrodczość u samców i samic obejmuje szkodliwe działanie na libido, zachowania seksualne, jakiekolwiek aspekty spermatogenezy i oogenezy, lub na hormonalną aktywność lub fizjologiczne reakcje mogące zakłócać zdolność do zapłodnienia, samo zapłodnienie lub rozwój zapłodnionego jaja, włączając jego implantację.

2 Toksyczność rozwojowa, w najszerszym znaczenie obejmuje każde oddziaływanie zakłócające rozwój potomstwa, przed i po urodzeniu. Obejmuje to skutki indukowane lub manifestowane zarówno prenatalnie, jak i postnatalnie. Obejmuje to skutki embriotoksyczne/fetotoksyczne, takie jak zmniejszenie wagi ciała, wzrostu, opóźnienia rozwojowe, toksyczność dla organów, śmierć, aborcję, defekty strukturalne (działanie teratogenne), defekty funkcjonalne, defekty peripostnatalne i upośledzenie umysłowe lub fizyczne rozwoju, włączając normalny rozwój w okresie dojrzewania.

Klasyfikacja substancji chemicznych jako toksycznych dla rozrodczości ma na celu zastosowanie dla substancji chemicznych, które mają samoistne lub określone właściwości wywołujące takie działania toksyczne. Substancje chemiczne nie powinny być klasyfikowane jako toksyczne dla rozrodczości, w przypadku gdy takie działania są wyłącznie wytwarzane jako nieokreślone wtórne następstwo innych toksycznych skutków. Substancje chemiczne najbardziej niepokojące to takie, które są toksyczne dla rozrodczości, przy poziomach ekspozycji nie wywołujących innych oznak toksyczności.

Umieszczenie związku w kategorii 1 z powodu wpływu na rozrodczość i/lub toksyczności na rozwój potomstwa, dokonane jest na podstawie danych epidemiologicznych. Umieszczenie w kategorii 2 lub 3 wykonano w pierwszym rzędzie na podstawie danych dotyczących zwierząt. Dane z badań in vitro lub badania na ptasich jajach są uznawane za dowody wspierające i mogą tylko wyjątkowo prowadzić do klasyfikacji, z braku danych in vivo.

Wspólnie z większością innego typu działań toksycznych substancje wykazujące toksyczność dla rozrodczości mają osiągać progi, poniżej których szkodliwe działanie nie jest widoczne. Nawet gdy wskazano wyraźne działania w badaniach na zwierzętach, ich przydatność dla ludzi jest wątpliwa, ponieważ podane dawki, na przykład w sytuacji, gdy jedyne działanie wskazano tylko przy wysokich dawkach lub w przypadku gdy istnieją znaczące różnice toksykokinetyczne, albo droga podawania jest niewłaściwa. Z tych lub podobnych przyczyn klasyfikuje się je do kategorii 3 lub nie podaje się żadnej klasyfikacji.

Załącznik V do dyrektywy określa badanie graniczne w przypadku substancji o niskiej toksyczności. Jeśli poziom dawkowania wynosi co najmniej 1.000 mg/kg drogą pokarmową nie powoduje działań toksycznych dla rozrodczości, badania przy innych poziomach dawkowania mogą być uznane za niekonieczne. Jeśli istnieją dostępne dane z badań przeprowadzonych z dawkami wyższymi niż dawka graniczna powyżej, dane muszą być ocenione wraz z innymi istotnymi danymi. W zwykłych okolicznościach przyjmuje się, że działania widoczne tylko przy dawkach przekraczających dawkę graniczną, niekoniecznie muszą prowadzić do klasyfikacji "toksyczny dla rozrodczości".

WPŁYW NA PŁODNOŚĆ

Dla klasyfikacji substancji w kategorii 2 dla osłabionej płodności zwykle powinny istnieć wyraźne oznaki u jednego z gatunków zwierząt, z dowodem wspierającym na mechanizm działania lub miejsce działania, lub chemicznej współzależności z innymi, znanymi środkami antypłodnościowymi lub innymi informacjami u ludzi mogącymi prowadzić do wniosku, że skutki prawdopodobnie będą obserwowane u ludzi. W przypadku gdy badania wykonano tylko na jednym gatunku, bez innych istotnych dowodów wspierających, właściwe jest sklasyfikowanie substancji w kategorii 3.

Ponieważ osłabienie płodności może okazać się nieokreślone, towarzyszące ogólnemu poważnemu działaniu toksycznemu lub wycieńczeniu, klasyfikacji do kategorii 2 dokonuje się tylko w przypadku, gdy są dowody kilku stopni specyficzności toksyczności na układ rozrodczy. Gdy wykazano, że osłabienie płodności w badaniach na zwierzętach było spowodowane zaburzeniem w kojarzeniu, wtedy sklasyfikowanie w kategorii 2 wymaga konieczności posiadania dowodów mechanizmu działania w celu interpretacji, czy jakikolwiek szkodliwy skutek, jak zaburzenia wzorców sekrecji hormonalnej, mogą prawdopodobnie zdarzyć się u ludzi.

TOKSYCZNOŚĆ ROZWOJOWA

Dla klasyfikacji do kategorii 2 powinny istnieć wyraźne dowody szkodliwych skutków w dobrze przeprowadzonych badaniach na jednym lub więcej gatunku. Ponieważ szkodliwe skutki w okresie ciąży lub postnatalne powodują wtórne skutki toksyczności u matek, zmniejszenie spożycia pokarmu i wody, stres u matki, brak opieki macierzyńskiej, określonych braków dietetycznych, słabych warunków hodowli, równoczesnych infekcji i tak dalej, ważne jest, aby obserwowane skutki występowały w dobrze prowadzonych badaniach i przy poziomach dawek niezwiązanych ze znacznym zatruciem matki. Droga oddziaływania jest również ważna. W szczególności wstrzyknięcie materiału drażniącego dootrzewnie może spowodować miejscowe uszkodzenie macicy i jej zawartości, a wyniki takich badań należy interpretować z ostrożnością i tylko na ich podstawie nie powinny prowadzić do klasyfikacji.

Klasyfikacja do kategorii 3 jest oparta na podobnych kryteriach jak w przypadku kategorii 2, lecz stosuje się ją w przypadku, gdy projekt doświadczalny posiada braki, które powodują, że wnioski są mniej przekonujące, lub w przypadku, gdy nie można wykluczyć, że skutki prawdopodobnie zostały spowodowane nieszczególnymi wpływami takimi jak ogólna toksyczność.

Zasadniczo klasyfikację do kategorii 3 lub nieklasyfikowanie, należy ustalić ad hoc, gdy odnotowano tylko działania jako małe zmiany w częstości defektów spontanicznych, małych zmian w proporcjach wspólnych wariancji takich jak są obserwowane w badaniach szkieletu lub w małych różnicach w ocenianym rozwoju postnatalnym.

Objawy w czasie trwania laktacji

Substancje, które są sklasyfikowane jako toksyczne dla rozrodczości i które także wzbudzają niepokój z powodu ich działania na laktację, powinny być etykietowane dodatkowo za pomocą R64 (patrz kryteria w ppkt 3.2.8).

Do celów klasyfikacji skutki toksyczne na potomstwo wynikają tylko z oddziaływania poprzez mleko karmiącej matki lub skutki toksyczne powstające z bezpośredniej ekspozycji dziecka na działanie substancji nie powodują klasyfikacji jako "toksyczny dla rozrodczości", dopóki takie skutki nie spowodują uszkodzenia rozwoju potomstwa.

Substancje, które nie są sklasyfikowane jako toksyczne dla rozrodczości, ale powodują obawę, że mogą być toksyczne, gdy są przenoszone do dziecka w czasie trwania okresu laktacji, powinny być etykietowane za pomocą R64 (patrz kryteria w ppkt 3.2.8). Niniejsze wyrażenie "R" może być również właściwe dla substancji, które działają na ilość lub jakość mleka.

R64 jest zwykle oznaczany na podstawie:

a) badań toksykokinetycznych wskazujących prawdopodobieństwo, że substancja będzie obecna w potencjalnie toksycznym poziomie w mleku matki karmiącej; i/lub

b) na podstawie wyników badań jednego lub dwu pokoleń u zwierząt, wykazujących szkodliwe skutki u potomstwa spowodowane przez przeniesienie substancji mlekiem; i/lub

c) na podstawie dowodów u ludzi wskazujących na ryzyko u dzieci w okresie laktacyjnym.

Substancje, które są znane z kumulacji w organizmie, mogące uwalniać się następnie do mleka w czasie trwania laktacji mogą być etykietowane za pomocą R33 i R64.

4.2.4. Procedura klasyfikacji preparatów dotycząca szczególnego wpływu na zdrowie

Jeśli preparaty zawierają jedną lub więcej substancji sklasyfikowanych w odniesieniu do kryteriów ustanowionych powyżej, muszą być one sklasyfikowane zgodnie z kryteriami określonymi w części A.7-9 i części B.6 w załączniku II do dyrektywy 1999/45/WE (graniczne stężenia są w załączniku i do niniejszej dyrektywy albo w części B.6 załącznika II do dyrektywy 1999/45/WE w przypadku gdy rozważana substancja lub substancje nie znajdują się w załączniku i lub są przedstawione bez stężeń granicznych).

5. KLASYFIKACJA NA PODSTAWIE WPŁYWU NA ŚRODOWISKO NATURALNE

5.1. Wprowadzenie

Głównym celem klasyfikowania substancji i preparatów niebezpiecznych dla środowiska naturalnego jest alarmowanie użytkownika o szkodliwości tych substancji i preparatów obecnych w ekosystemach. Chociaż te kryteria odnoszą się do ekosystemów wodnych, wiadome jest, że niektóre substancje i preparaty oddziaływają równocześnie lub alternatywnie na inne ekosystemy, których składniki są w zakresie od mikroflory i mikrofauny gleby do naczelnych.

Kryteria określone poniżej pochodzą bezpośrednio z metod badań określonych w załączniku V w zakresie, w jakim są one wspomniane. Metody badań wymagane dla "podstawowego zestawu" określonego w załączniku VII są ograniczone, a informacje z nich uzyskane mogą być niewystarczające do właściwej klasyfikacji. Klasyfikacja może wymagać dodatkowych danych uzyskanych z poziomu 1 (załącznik VIII) lub innych równoważnych badań. Ponadto sklasyfikowane substancje mogą podlegać przeglądowi w świetle innych nowych danych.

Do celów klasyfikacji i etykietowania oraz uwzględniając bieżący stan wiedzy takie substancje i preparaty podzielono na dwie grupy, zgodnie z ich działaniem ostrym i długoterminowym w systemach wodnych lub ich ostrym i/lub długoterminowym działaniem w systemach niewodnych.

5.1.1. Klasyfikacja substancji jest zwykle wykonywana na podstawie danych doświadczalnych dla ostrej toksyczności w środowisku wodnym, degradacji i log P_ow (lub BCF, jeśli dostępne).

5.1.2. Klasyfikacja preparatów jest zwykle przeprowadzana na podstawie konwencjonalnej metody określonej w art. 7 część A i B załącznika III do dyrektywy 1999/45/WE. W niniejszym przypadku klasyfikacja jest oparta na poszczególnych stężeniach granicznych:

- w załączniku I do niniejszej dyrektywy,

- lub w części B załącznika III do dyrektywy 1999/45/WE, w przypadku gdy substancja lub substancje nie są zamieszczone w załączniku I do niniejszej dyrektywy lub są zamieszczone bez stężeń granicznych.

5.1.3. Zwykle klasyfikacja preparatów jest wykonywana na podstawie metody konwencjonalnej. Jednakże dla oznaczenia ostrej toksyczności dla środowiska wodnego występują przypadki, dla których właściwe jest przeprowadzenie badań na preparacie. Wyniki tych badań na preparacie modyfikują tylko klasyfikację dotyczącą toksyczności ostrej dla środowiska wodnego, która musi być uzyskana przez zastosowanie metody konwencjonalnej. Jeśli takie badania zostały wybrane przez osobę odpowiedzialną za wprowadzenie do obrotu, należy zapewnić, aby kryteria jakości metod badań w części C załącznika V do niniejszej dyrektywy zostały spełnione. Ponadto badania mają być przeprowadzone na wszystkich trzech grupach gatunków zgodnie z kryteriami w niniejszym załączniku (algi, Daphnia i ryby), poza klasyfikacją najwyższego niebezpieczeństwa dotyczącą ostrej toksyczności dla środowiska wodnego przyznanej preparatowi, po badaniu na jednym gatunku lub wynikach badania już wykonanego przed wejściem w życie dyrektywy 1999/45/WE.

5.2. Kryteria dotyczące klasyfikacji, wskazania niebezpieczeństwa, wyboru wyrażeń oznaczających zagrożenie

Kryteria klasyfikacji dla substancji w ppkt 5.2.1 stosują się tylko do preparatów, w przypadku gdy były zbadane zgodnie z ppkt 5.1.3.

5.2.1. Środowisko wodne

5.2.1.1. Substancje są sklasyfikowane jako niebezpieczne dla środowiska naturalnego i oznaczane symbolem "N" i właściwym oznaczeniem niebezpieczeństwa oraz wyrażeniem oznaczającym zagrożenie zgodnie z następującymi kryteriami:

R50 Bardzo toksyczny dla organizmów wodnych

R53 Może powodować długoterminowe szkodliwe zmiany w środowisku wodnym.

Ostra toksyczność:		96 h LC₅₀ (dla ryb)	≤ 1 mg/l
	lub	48 h EC₅₀ (dla Daphnia)	≤ 1 mg/l
	lub	72 h IC₅₀ (dla alg)	≤ 1 mg/l

- substancja nie jest łatwo degradowalna, lub

- log P_ow (log współczynnika podziału oktanol/woda) ≤ 3,0 (chyba że oznaczona doświadczalnie BCF ≤ 100).

R50 Bardzo toksyczny dla organizmów wodnych

Ostra toksyczność:		96 h LC₅₀ (dla ryb)	≤ 1 mg/l
	lub	48 h EC₅₀ (dla daphnia)	≤ 1 mg/l
	lub	72 h IC₅₀ (dla alg)	≤ 1 mg/l

R51 Toksyczny dla organizmów wodnych, i

R53 Może powodować długoterminowe szkodliwe zmiany w środowisku wodnym.

Ostra toksyczność:		96 h LC₃₀ (dla ryb)	1 mg/l < LC₅₀ ≤ 10 mg/l
	lub	48 h EC₅₀ (dla daphnia)	1 mg/l < EC₅₀ ≤ 10 mg/l
	lub	72 h IC₅₀ (dla alg)	1 mg/l < IC₅₀ ≤ 10 mg/l

- substancja nie jest łatwo degradowalna, lub

- log P_ow ≥ 3,0 (chyba że oznaczona doświadczalnie BCF ≤ 100).

5.2.1.2. Substancje są sklasyfikowane jako niebezpieczne dla środowiska naturalnego zgodnie z kryteriami określonymi poniżej. Wyrażenia oznaczające zagrożenie są również przypisane zgodnie z następującymi kryteriami:

R52 Szkodliwy dla organizmów wodnych, i

R53 Może powodować długoterminowe szkodliwe zmiany w środowisku wodnym

Ostra toksyczność:		96 h LC₅₀ (dla ryb)	10 mg/l < LC₅₀ ≤ 100 mg/l
	lub	48 h EC₅₀ (dla daphnia)	10 mg/l < EC₅₀ ≤ 100 mg/l
	lub	72 h IC₅₀ (dla alg)	10 mg/l < IC₅₀≤ 100 mg/l

substancja nie jest łatwo degradowalna.

Niniejsze kryterium ma zastosowanie, chyba że istnieją dodatkowe naukowe dowody dotyczące degradacji i/lub toksyczności, wystarczające do zapewnienia, że dana substancja lub produkty jej rozkładu nie będą stanowiły potencjalnego długoterminowego i/lub opóźnionego niebezpieczeństwa dla środowiska wodnego. Takie dodatkowe naukowe dowody powinny być zwykle oparte na badaniach wymaganych w poziomie 1 (załącznik VIII), lub badania równoważnej wartości, mogące zawierać:

i) udowodniony potencjał do szybkiej degradacji w środowisku wodnym;

ii) brak skutków przewlekłej toksyczności przy stężeniu 1,0 mg/litr, np. nie obserwowany skutek stężenia większego niż 1,0 mg/litr ustalony w badaniach przedłużonej toksyczności na rybach lub daphnia.

R52 Szkodliwy dla organizmów wodnych

Substancje niespełniające kryteriów wymienionych powyżej w niniejszym rozdziale, ale które na podstawie dostępnych danych dotyczących ich toksyczności mogą mimo to stanowić niebezpieczeństwo dla struktury i/lub działania wodnych ekosystemów.

R53 Może powodować długoterminowe szkodliwe zmiany w środowisku wodnym

Substancje nie spełniające kryteriów wymienionych powyżej w niniejszym rozdziale, ale które na podstawie dostępnych danych dotyczących ich trwałości, potencjału kumulowania się i przewidywanego lub obserwowanego losu środowiska i postępowania mogą mimo to stwarzać długoterminowe i/lub opóźnione niebezpieczeństwo dla struktury i/lub działania wodnych ekosystemów.

Na przykład, substancje słabo rozpuszczalne w wodzie, tj. substancje o rozpuszczalności mniejszej niż 1 mg/l będą objęte tym kryterium, jeśli:

a) nie są łatwo degradowalne; i

b) log P_ow ≥ 3,0 (chyba że oznaczona doświadczalnie BCF ≤ 100).

Takie dodatkowe naukowe dowody powinny zwykle być oparte na badaniach wymaganych na poziomie 1 (załącznik VIII) lub badaniach równoważnej wartości i mogłyby zawierać:

i) udowodniony potencjał do szybkiej degradacji w środowisku wodnym;

ii) brak skutków przewlekłej toksyczności w granicy rozpuszczalności, to jest nieobserwowany skutek stężenia większy niż granica rozpuszczalności, ustalona w badaniach przedłużonej toksyczności dla ryb lub daphnia.

5.2.1.3. Uwagi odnoszące się do określenia IC₅₀ dla alg i zdolności do degradacji

- w przypadku gdy można to przedstawić w przypadku mocno zabarwionych substancji, że wzrost alg jest hamowany wyłącznie w wyniku redukcji intensywności światła, to IC₅₀dla 72 godzin dla alg nie powinny być używane jako podstawa do klasyfikacji,

- substancje są uznane za łatwo degradowalne, jeżeli spełniają następujące kryteria

a) jeżeli w 28-dniowych badaniach biodegradacji osiągane są następujące poziomy degradacji:

- w badaniach opartych o rozpuszczalny węgiel organiczny: 70%,

- w badaniach opartych na ubytku tlenu lub generacji dwutlenku węgla: 60% maksimum teoretycznego.

Te poziomy biodegradacji muszą być uzyskane w ciągu 10 dni od początku degradacji, to jest punktu czasu w którym 10% substancji ulegnie degradacji; lub

b) w tych przypadkach, gdy dostępne są tylko dane COD i BOD5, gdy stosunek BOD5/COD jest większy lub równy 0,5; lub

c) jeśli inne przekonywujące dowody są dostępne do wykazania, że substancja ulega degradacji (biotycznej i/lub abiotycznej) w środowisku wodnym do poziomu > 70% w czasie 28-dniowego okresu.

5.2.2. Środowisko niewodne

5.2.2.1. Substancje i preparaty są sklasyfikowane jako niebezpieczne dla środowiska naturalnego i oznaczane symbolem "N" i właściwym oznaczeniem niebezpieczeństwa oraz przypisanym wyrażeniem oznaczającym zagrożenie zgodnie z następującymi kryteriami:

R54 Toksyczny dla roślin

R55 Toksyczny dla zwierząt

R56 Toksyczny dla organizmów gleby

R57 Toksyczny dla pszczół

R58 Może powodować długoterminowe szkodliwe zmiany w środowisku

Substancje i preparaty, które na podstawie dostępnych danych dotyczących ich trwałości, potencjału kumulowania się i prognozowanego lub obserwowanego przeznaczenia środowiska i zachowania mogą mimo to stanowić niebezpieczeństwo, natychmiastowe lub długoterminowe i/lub opóźnione dla struktury i/lub działania wodnych ekosystemów, innych niż te objęte ppkt 5.2.1. Szczegółowe kryteria będą rozpatrzone później.

5.2.2.2. Substancje i preparaty są sklasyfikowane jako niebezpieczne dla środowiska naturalnego i oznaczane symbolem "N" i właściwym oznaczeniem niebezpieczeństwa tam, gdzie to ma zastosowanie, oraz przypisanym wyrażeniem oznaczającym zagrożenie zgodnie z następującymi kryteriami:

R59 Niebezpieczny dla warstwy ozonowej

Substancje, które na podstawie dostępnych danych dotyczących ich właściwości i przewidywanego lub obserwowanego losu środowiska i zachowania mogą stanowić niebezpieczeństwo dla struktury i/lub działania stratosferycznej warstwy ozonowej. Obejmuje to substancje, które są wymienione w załączniku I do rozporządzenia Rady (WE) nr 2037/2000 w sprawie substancji zubażających warstwę ozonową (Dz.U. L 244 z 29.9.2000, str. 1) i jego późniejsze zmiany.

Preparaty są sklasyfikowane na podstawie metody konwencjonalnej określonej w art. 7 i w częściach A i B załącznika III do dyrektywy 1999/45/WE.

6. WYBÓR WYRAŻEŃ ZALECAJĄCYCH BEZPIECZEŃSTWO

6.1. Wprowadzenie

Wyrażenia zalecające bezpieczeństwo (wyrażenia-S) są przypisywane niebezpiecznym substancjom i preparatom zgodnie z następującymi ogólnymi kryteriami. Ponadto dla niektórych preparatów zalecenia dotyczące bezpieczeństwa wymienione w załączniku V do dyrektywy 1999/45/WE są obowiązkowe.

W każdym przypadku gdy producent jest wymieniony w rozdziale 6, odnosi się to do osoby odpowiedzialnej za wprowadzenie substancji lub preparatu do obrotu.

6.2. Wyrażenia bezpieczeństwa dla substancji i preparatów

S1 Używać właściwych opakowań dla uniknięcia skażenia środowiska. Przechowywać w zamknięciu

- Zastosowanie:

- bardzo toksyczne, toksyczne i żrące substancje i preparaty.

- Kryteria użycia:

- obowiązkowe dla tych substancji i preparatów wymienionych powyżej, jeśli są sprzedawane ogółowi społeczeństwa.

S2 Przechowywać poza zasięgiem dzieci

- Zastosowanie:

- wszystkie substancje niebezpieczne i preparaty.

- Kryteria użycia:

- obowiązkowe dla wszystkich niebezpiecznych substancji i preparatów sprzedawanych ogółowi społeczeństwa, z wyjątkiem tych klasyfikowanych tylko jako niebezpieczne dla środowiska naturalnego.

S3 Przechowywać w chłodnym miejscu

- Zastosowanie:

- organiczne nadtlenki,

- inne substancje niebezpieczne i preparaty o temperaturze wrzenia ≤ 40° C.

- Kryteria użycia:

- obowiązkowe dla organicznych nadtlenków, chyba że użyto S47,

- zalecany dla innych substancji niebezpiecznych i preparatów o temperaturze wrzenia ≤ 40° C.

S4 Przechowywać z dala od pomieszczeń mieszkalnych

- Zastosowanie:

- bardzo toksyczne i toksyczne substancje i preparaty.

- Kryteria użycia:

- zwykle ograniczone do bardzo toksycznych i toksycznych substancji i preparatów, gdy to pożądane w celu uzupełnienia S13; na przykład, gdy występuje ryzyko wdychania i substancje lub preparaty powinny być przechowywane poza pomieszczeniami mieszkalnymi. Zalecenie nie ma na celu wykluczenia właściwego użycia tych substancji lub preparatów w pomieszczeniach mieszkalnych.

S5 Przechowywać zawartość według ... (właściwa ciecz która ma być określona przez producenta)

- Zastosowanie:

- samorzutnie zapalne substancje i preparaty w stanie stałym.

- Kryteria użycia:

- zwykle ograniczone do szczególnych przypadków, np. sodu, potasu lub białego fosforu.

S6 Przechowywać według ... (gaz obojętny, ściśle określony przez producenta)

- Zastosowanie:

- substancje niebezpieczne i preparaty, które muszą być przechowywane w atmosferze gazu obojętnego.

- Kryteria użycia:

- zwykle ograniczone do szczególnych przypadków, np. niektóre związki metaloorganiczne.

S7 Przechowywać pojemnik szczelnie zamknięty

- Zastosowanie:

- organiczne nadtlenki,

- substancje i preparaty wydzielające bardzo toksyczne, toksyczne, szkodliwe lub skrajnie łatwopalne gazy,

- substancje i preparaty, które w kontakcie z wilgocią wydzielają skrajnie łatwopalne gazy,

- wysoce łatwopalne ciała stałe.

- Kryteria użycia:

- obowiązkowe dla organicznych nadtlenków,

- zalecane na innych polach zastosowania wymienionych powyżej.

S8 Przechowywać pojemnik w suchym miejscu

- Zastosowanie:

- substancje i preparaty, które reagują gwałtownie z wodą,

- substancje i preparaty, które w kontakcie z wodą uwalniają skrajnie łatwopalne gazy,

- substancje i preparaty, które w kontakcie z wodą uwalniają bardzo toksyczne lub toksyczne gazy.

- Kryteria użycia:

- zwykle ograniczone do dziedzin zastosowania wymienionych powyżej, gdy konieczne wzmocnienie ostrzeżeń danych przez R14, R15 w szczególności, oraz R29.

S9 Przechowywać pojemnik w miejscu z dobrą cyrkulacją powietrza

- Zastosowanie:

- lotne substancje i preparaty wydzielające bardzo toksyczne, toksyczne lub szkodliwe opary,

- skrajnie łatwopalne lub wysoce łatwopalne ciecze i skrajnie łatwopalne gazy.

- Kryteria użycia:

- zalecane dla lotnych substancji i preparatów wydzielających bardzo toksyczne, toksyczne lub szkodliwe opary,

- zalecane dla skrajnie łatwopalnych lub wysoce łatwopalnych cieczy lub skrajnie łatwopalnych gazów.

S12 Nie przechowywać uszczelnionego pojemnika

- Zastosowanie:

- substancje i preparaty, które mogą ze względu na uwalnianie gazów lub oparów rozerwać pojemniki.

- Kryteria użycia:

- zwykle ograniczone do szczególnych przypadków wymienionych wyżej.

S13 Przechowywać z dala od żywności, napojów i karmy dla zwierząt

- Zastosowanie:

- bardzo toksyczne, toksyczne i szkodliwe substancje i preparaty.

- Kryteria użycia:

- zalecane, kiedy takie substancje i preparaty mogą być prawdopodobnie stosowane przez ogół społeczeństwa.

S14 Przechowywać z dala od ... (niezgodne materiały wskazane przez producenta)

- Zastosowanie:

- nadtlenki organiczne.

- Kryteria użycia:

- obowiązkowe i zwykle ograniczone do nadtlenków organicznych. Jednakże mogą być używane w wyjątkowych przypadkach, gdy jest możliwa niezgodność stanowiąca szczególne ryzyko.

S15 Przechowywać z dala od ciepła

- Zastosowanie:

- substancje i preparaty, które mogą się rozkładać lub które mogą reagować samorzutnie wskutek ciepła.

- Kryteria użycia:

- zwykle ograniczony do szczególnych przypadków, np. monomerów, lecz nieprzypisanych, jeśli już zastosowano oznaczenia ryzyka R2, R3 i/lub R5.

S16 Przechowywać z dala od zapłonu - Nie palić

- Zastosowanie:

- skrajnie łatwopalne lub wysoce łatwopalne ciecze i skrajnie łatwopalne gazy.

- Kryteria użycia:

- zalecane dla substancji i preparatów wymienionych wyżej, lecz nie oznacza się, gdy już zastosowano oznaczenia ryzyka R2, R3 i/lub R5.

S17 Przechowywać z dala od materiałów palnych

- Zastosowanie:

- substancje i preparaty, które mogą stanowić wybuchowe lub samorzutnie zapalające się mieszaniny z materiałem palnym.

- Kryteria użycia:

- stosowane do użycia w szczególnych przypadkach, np. do podkreślenia R8 i R9.

S18 Obchodzić się i otwierać pojemnik z zachowaniem ostrożności

- Zastosowanie:

- substancje i preparaty zdolne do wytworzenia nadciśnienia w pojemniku,

- substancje i preparaty, które mogą stanowić wybuchowe nadtlenki.

- Kryteria użycia:

- zwykle ograniczone do wyżej wymienionych przypadków, gdy istnieje ryzyko uszkodzenia oczu i/lub substancje i preparaty mogą być prawdopodobnie używane przez ogół społeczeństwa.

S20 Podczas stosowania nie jeść i nie pić

- Zastosowanie:

- substancje i preparaty bardzo toksyczne, toksyczne i żrące.

- Kryteria użycia:

- zwykle ograniczone do szczególnych przypadków (np. arsen i związki arsenu, fluorooctany), w szczególności gdy którykolwiek może być używany przez ogół społeczeństwa.

S21 Podczas stosowania nie palić

- Zastosowanie:

- substancje i preparaty, które wytwarzają toksyczne produkty przy spalaniu.

- Kryteria użycia:

- zwykle ograniczone do szczególnych przypadków (np. związki chlorowcopochodne).

S22 Nie wdychać pyłu

- Zastosowanie:

- wszystkie substancje i preparaty w stanie stałym niebezpieczne dla zdrowia.

- Kryteria użycia:

- obowiązkowe dla tych substancji i preparatów wymienionych powyżej, którym przypisano R42,

- zalecane dla tych substancji i preparatów wymienionych powyżej, które są stosowane w postaci możliwego do wchłonięcia pyłu i dla których nie jest znane zagrożenie dla zdrowia następujące poprzez wdychanie.

S23 Nie wdychać gazu/dymu/pary/aerozolu (właściwy opis określa producent)

- Zastosowanie:

- wszystkie ciekłe lub gazowe substancje i preparaty niebezpieczne dla zdrowia.

- Kryteria użycia:

- obowiązkowe dla tych substancji i preparatów wymienionych powyżej, którym przypisano oznaczenie ryzyka R42,

- obowiązkowe dla substancji i preparatów, które mogą być użyte w formie aerozoli. Dodatkowo muszą być przypisane S38 albo S51,

- zalecane gdy konieczne jest zwrócenie uwagi użytkownikowi na ryzyko związane z wdychaniem, nie wymienione w przypisanych oznaczeniach ryzyka "R".

S24 Unikać kontaktu ze skórą.

- Zastosowanie:

- wszystkie substancje i preparaty niebezpieczne dla zdrowia.

- Kryteria użycia:

- obowiązkowe dla tych substancji i preparatów, którym przypisano R43, chyba że przypisano już S36,

- zalecane, gdy konieczne jest zwrócenie uwagi użytkownikowi na ryzyko związane z kontaktem ze skórą, niewymienione w przypisanych oznaczeniach ryzyka (np. arestezja). Jednakże, mogą być używane do podkreślenia takich oznaczeń ryzyka.

S25 Unikać kontaktu z oczami

- Zastosowanie:

- wszystkie substancje i preparaty niebezpieczne dla zdrowia.

- Kryteria użycia:

- zalecane, gdy konieczne jest zwrócenie uwagi użytkownikowi na ryzyko związane z kontaktem z oczami, niewymienione w przypisanych oznaczeniach ryzyka "R". Jednakże mogą być używane do podkreślenia takich oznaczeń ryzyka "R",

- zalecane dla substancji, którym przypisano R34, R35, R36 lub R41, które prawdopodobnie mogą być używane przez ogół społeczeństwa.

S26 W przypadku kontaktu z oczami przemyć natychmiast dużą ilością wody i zwrócić się o pomoc lekarską

- Zastosowanie:

- żrące lub drażniące substancje i preparaty.

- Kryteria użycia:

- obowiązkowe dla żrących substancji i preparatów, i tych, którym został już przypisany R41,

- zalecane dla żrących substancji i preparatów, którym oznaczenie oznaczeniem ryzyka R36 już przypisano.

S27 Zdjąć natychmiast całą skażoną odzież

- Zastosowanie:

- bardzo toksyczne, toksyczne lub żrące substancje i preparaty.

- Kryteria użycia:

- obowiązkowe dla bardzo toksycznych substancji i preparatów, którym już przypisano R27 i które mogą być prawdopodobnie używane przez ogół społeczeństwa,

- zalecane dla bardzo toksycznych substancji i preparatów, którym przypisano już R27, stosowanym w przemyśle. Jednakże tego oznaczenia bezpieczeństwa nie powinno się stosować, gdy już przypisano S36,

- zalecane dla toksycznych substancji i preparatów, którym przypisano już R24, jak również dla żrących substancji i preparatów, które mogą być prawdopodobnie używane przez ogół społeczeństwa.

S28 Przy kontakcie ze skórą przemyć natychmiast dużą ilością ... (określa producent)

- Zastosowanie:

- bardzo toksyczne, toksyczne lub żrące substancje i preparaty.

- Kryteria użycia:

- obowiązkowe dla bardzo toksycznych substancji i preparatów,

- zalecane dla innych substancji i preparatów wymienionych wyżej, w szczególności gdy woda nie jest najbardziej właściwym płynem przemywającym,

- zalecane dla żrących substancji i preparatów, które prawdopodobnie mogą być używane przez ogół społeczeństwa.

S29 Nie wylewać do kanalizacji

- Zastosowanie:

- skrajnie lub wysoce łatwopalne ciecze niemieszające się z wodą,

- bardzo toksyczne i toksyczne substancje i preparaty,

- substancje i preparaty niebezpieczne dla środowiska naturalnego.

- Kryteria użycia:

- obowiązkowe dla substancji i preparatów niebezpiecznych dla środowiska naturalnego i oznaczone symbolem "N", które prawdopodobnie mogą być używane przez ogół społeczeństwa, chyba że jest to zamierzone użycie,

- zalecane dla innych substancji i preparatów wymienionych powyżej, które prawdopodobnie mogą być używane przez ogół społeczeństwa, chyba że jest to zamierzone użycie.

S30 Nigdy nie dodawać wody do tej substancji

- Zastosowanie:

- substancje i preparaty, które reagują gwałtownie z wodą.

- Kryteria użycia:

- zwykle ograniczone do szczególnych przypadków (np. kwas siarkowy) i mogą być stosowane jako właściwe do podania możliwe jak najbardziej jasnej informacji albo podkreślającej R14, albo jako alternatywa do R14.

S33 Podjąć środki ostrożności przeciwko wyładowaniu elektrostatycznemu

- Zastosowanie:

- skrajnie lub wysoce łatwopalne substancje i preparaty.

- Kryteria użycia:

- zalecane dla substancji i preparatów używanych w przemyśle, nieabsorbujących wilgoci. W rzeczywistości nigdy nieużywane jako substancje i preparaty wprowadzane do obrotu dla użycia przez ogół społeczeństwa.

S35 Materiał ten i jego opakowanie muszą być unieszkodliwiane w bezpieczny sposób

- Zastosowanie:

- wszystkie substancje niebezpieczne i preparaty.

- Kryteria użycia:

- zalecane dla substancji i preparatów, w przypadku gdy wymagane są szczególne informacje do celu zapewnienia prawidłowego usuwania.

S36 Nosić odpowiednią odzież ochronną

- Zastosowanie:

- nadtlenki organiczne,

- bardzo toksyczne, toksyczne lub szkodliwe substancje i preparaty,

- żrące substancje i preparaty.

- Kryteria użycia:

- obowiązkowe dla bardzo toksycznych i żrących substancji i preparatów,

- obowiązkowe dla tych substancji i preparatów, do których przypisano R21 albo R24,

- obowiązkowe dla kategorii 3 rakotwórczych, mutagennych i substancji toksycznych dla rozrodczości, poza działaniem wytwarzanym jedynie przez wdychanie substancji lub preparatu,

- obowiązkowa dla nadtlenków organicznych,

- zalecane dla toksycznych substancji i preparatów, jeśli wartość LD₅₀ przez skórę jest nieznana, a substancje i preparaty mogą prawdopodobnie być toksyczne w kontakcie ze skórą,

- zalecane dla substancji i preparatów używanych w przemyśle, które są zdolne do uszkodzenia zdrowia przy przedłużonej ekspozycji.

S37 Nosić odpowiednie rękawice ochronne

- Zastosowanie:

- bardzo toksyczne, toksyczne, szkodliwe lub żrące substancje i preparaty,

- nadtlenki organiczne,

- substancje i preparaty drażniące dla skóry lub powodujące uczulenie poprzez kontakt ze skórą.

- Kryteria użycia:

- obowiązkowe dla bardzo toksycznych i żrących substancji i preparatów,

- obowiązkowe dla tych substancji i preparatów, którym przypisano albo R21, R24 albo R43,

- obowiązkowe dla kategorii 3 rakotwórczych, mutagennych i substancji toksycznych dla rozrodczości, poza działaniem wytwarzanym jedynie przez wdychanie substancji lub preparatu,

- obowiązkowe dla nadtlenków organicznych,

- zalecane dla toksycznych substancji i preparatów, jeśli wartość LD₅₀ przez skórę jest nieznana, a substancje i preparaty mogą prawdopodobnie być szkodliwe w kontakcie ze skórą,

- zalecane dla substancji i preparatów drażniących skórę.

S38 W przypadku niedostatecznej wentylacji nosić odpowiedni sprzęt do oddychania

- Zastosowanie:

- bardzo toksyczne lub toksyczne substancje i preparaty.

- Kryteria użycia:

- zwykle ograniczone do szczególnych przypadków, włączając użycie bardzo toksycznych lub toksycznych substancji i preparatów w przemyśle lub w rolnictwie.

S39 Nosić ochronę oczu/twarzy

- Zastosowanie:

- organiczne nadtlenki,

- żrące substancje i preparaty, włączając drażniące, które dają wzrost ryzyka poważnego uszkodzenia oczu,

- bardzo toksyczne i toksyczne substancje i preparaty.

- Kryteria użycia:

- obowiązkowe dla tych substancji i preparatów, którym przypisano R34, R35 lub R41,

- obowiązkowe dla nadtlenków organicznych,

- zalecane, jeśli konieczne zwrócenie uwagi użytkownika na ryzyko kontaktu z oczyma, niewspomniane w przypisanych oznaczeniach ryzyka "R",

- zwykle ograniczone do wyjątkowych przypadków dla bardzo toksycznych i toksycznych substancji i preparatów, w przypadku gdy istnieje ryzyko opryskania i są one prawdopodobnie łatwo absorbowane przez skórę.

S40 Do czyszczenia podłogi i wszystkich zanieczyszczonych obiektów tym materiałem używać ... (określa producent)

- Zastosowanie:

- wszystkie substancje niebezpieczne i preparaty.

- Kryteria użycia:

- zwykle ograniczone do tych substancji i preparatów niebezpiecznych, dla których woda nie jest uznana za odpowiedni środek czyszczący (np. gdy konieczna jest absorpcja przez sproszkowany materiał, rozpuszczenie przez rozpuszczalnik i tak dalej) oraz w przypadku, gdy z przyczyn zdrowotnych i/lub bezpieczeństwa ważne jest umieszczenie ostrzeżenia na etykiecie.

S41 W przypadku pożaru i/lub wybuchu nie wdychać dymu

- Zastosowanie:

- substancje i preparaty, które podczas spalania dają bardzo toksyczne i toksyczne gazy.

- Kryteria użycia:

- zwykle ograniczone do szczególnych przypadków.

S42 Podczas zadymiania/rozpylania nosić odpowiedni sprzęt do oddychania (właściwy opis określa producent)

- Zastosowanie:

- substancje i preparaty przeznaczone do tego użytku, ale które mogą stać się niebezpieczne dla zdrowia i bezpieczeństwa użytkownika, bez podjęcia właściwych środków ostrożności.

- Kryteria użycia:

- zwykle ograniczone do szczególnych przypadków.

S43 W przypadku pożaru, używać ... (wskazać lokalizację i dokładny typ sprzętu przeciwpożarowego. Jeżeli woda zwiększa zagrożenie dodać: "nigdy nie stosować wody")

- Zastosowanie:

- skrajnie łatwopalne, wysoce łatwopalne i łatwopalne substancje i preparaty.

- Kryteria użycia:

- obowiązkowe dla substancji i preparatów, które w kontakcie z wodą lub parą uwalniają skrajnie łatwopalne gazy,

- zalecane dla skrajnie łatwopalnych, wysoce łatwopalnych i łatwopalnych substancji i preparatów, w szczególności gdy nie mieszają się z wodą.

S45 W przypadku awarii lub złego samopoczucia, niezwłocznie zgłosić się do lekarza (wskazać etykietę substancji, gdy to możliwe)

- Zastosowanie:

- bardzo toksyczne substancje i preparaty,

- toksyczne i żrące substancje i preparaty,

- substancje i preparaty powodujące uczulenie przez wdychanie.

- Kryteria użycia:

- obowiązkowe dla substancji i preparatów wyżej wymienionych.

S46 W przypadku połknięcia natychmiast zgłosić się do lekarza i wskazać opakowanie lub etykietę

- Zastosowanie:

- wszystkie substancje niebezpieczne i preparaty, inne niż te, które są bardzo toksyczne, toksyczne, żrące lub niebezpieczne dla środowiska naturalnego.

- Kryteria użycia:

- ogólnie obowiązujące dla wszystkich substancji niebezpiecznych i preparatów wymienionych wyżej, które mogą być prawdopodobnie używane przez ogół społeczeństwa, oprócz tych gdzie nie ma przyczyny obawy o jakiekolwiek niebezpieczeństwo z powodu spożycia, szczególnie przez dzieci.

S47 Przechowywać w temperaturze nieprzekraczającej ... ° C (która ma być określona przez producenta)

- Zastosowanie:

- substancje i preparaty, które stają się niestabilne w pewnej temperaturze.

- Kryteria użycia:

- zwykle ograniczone do szczególnych przypadków (np. niektóre nadtlenki organiczne).

S48 Zwilżać za pomocą... (właściwy materiał ma być określony przez producenta)

- Zastosowanie:

- substancje i preparaty, które stają się bardzo wrażliwe na iskrzenie, tarcie lub uderzenie po wyschnięciu.

- Kryteria użycia:

- zwykle ograniczone do szczególnych przypadków, np. nitrocelulozy.

S49 Przechowywać tylko w oryginalnym opakowaniu

- Zastosowanie:

- substancje i preparaty czułe na rozkład katalityczny.

- Kryteria użycia:

- substancje i preparaty czułe na katalityczny rozkład, np. niektóre nadtlenki organiczne.

S50 Nie mieszać z ... (określa producent)

- Zastosowanie:

- substancje i preparaty, które mogą reagować z określonymi produktami, wydzielając bardzo toksyczne lub toksyczne gazy,

- nadtlenki organiczne.

- Kryteria użycia:

- zalecane dla substancji i preparatów wymienionych powyżej, które prawdopodobnie mogą być używane przez ogół społeczeństwa, gdy jest to lepszą alternatywą niż R31 lub R32,

- obowiązkowe dla pewnych nadtlenków, które mogą gwałtownie reagować z przyspieszaczami lub promotorami.

S51 Stosować tylko w pomieszczeniach z dobrą cyrkulacją powietrza

- Zastosowanie:

- substancje i preparaty, które mogą być lub są przeznaczone do produkcji par, pyłów, aerozoli, dymów, mgieł itd., powodujące wzrost ryzyka wdychania, pożaru lub wybuchu.

- Kryteria użycia:

- zalecane kiedy użycie S38 nie jest właściwe. Także ważne, kiedy takie substancje i preparaty prawdopodobnie mogą być używane przez ogół społeczeństwa.

S52 Nie zaleca się używać wewnątrz pomieszczeń na dużych powierzchniach

- Zastosowanie:

- lotne, bardzo toksyczne, toksyczne i szkodliwe substancje i preparaty je zawierające.

- Kryteria użycia:

- zalecane, gdy możliwe jest uszkodzenie zdrowia spowodowane przedłużoną ekspozycją na te substancje i preparaty, z powodu ich ulatniania z dużych obrabianych powierzchni w domu lub innych zamkniętych miejscach gromadzenia się ludzi.

S53 Unikać ekspozycji - przed użyciem zapoznać się z instrukcją

- Zastosowanie:

- substancje i preparaty, które są rakotwórcze, mutagenne i/lub toksyczne dla rozrodczości.

- Kryteria użycia:

- obowiązkowe dla wyżej wymienionych substancji i preparatów, do których zostało przypisane przynajmniej jedno z następujących oznaczeń R: R45, R46, R49, R60 lub R61.

S56 Unieszkodliwianie tego materiału i jego opakowania w punkcie zbierania niebezpiecznych lub specjalnych odpadów

- Zastosowanie:

- wszystkie substancje i preparaty niebezpieczne.

- Kryteria użycia:

- zalecane dla wszystkich substancji i preparatów niebezpiecznych, które prawdopodobnie mogą być używane przez ogół społeczeństwa, dla których wymagane jest szczególne usunięcie.

S57 Używać właściwych opakowań dla uniknięcia skażenia środowiska

- Zastosowanie:

- substancje i preparaty, które zostały oznaczone symbolem "N".

- Kryteria użycia:

- zwykle ograniczone do substancji i preparatów, które nie mogą być używane przez ogół społeczeństwa.

S59 Zwrócić się do producenta o informację w sprawie odzysku/powtórnego przetworzenia

- Zastosowanie:

- wszystkie substancje i preparaty niebezpieczne.

- Kryteria użycia:

- obowiązkowy dla substancji i preparatów niebezpiecznych dla warstwy ozonowej,

- zalecany dla innych substancji i preparatów, dla których zalecane jest powtórne przetwarzanie.

S60 Ten materiał i jego opakowanie muszą być usuwane jako odpady niebezpieczne

- Zastosowanie:

- wszystkie substancje niebezpieczne i preparaty.

- Kryteria użycia:

- zalecane dla substancji i preparatów, które nie mogą być używane przez ogół społeczeństwa, i w przypadku, gdy nie przypisano S35.

S61 Unikać uwalniania do środowiska naturalnego. Odnieść się do specjalistycznych arkuszy danych dotyczących instrukcji/bezpieczeństwa

- Zastosowanie:

- substancje i preparaty niebezpieczne dla środowiska naturalnego.

- Kryteria użycia:

- zwykle używany dla substancji i preparatów, które oznaczono symbolem "N",

- zalecane dla wszystkich substancji i preparatów, sklasyfikowanych jako niebezpieczne dla środowiska naturalnego, nieobjętych powyższym.

S62 W razie połknięcia nie wywoływać wymiotów; zwrócić się natychmiast do lekarza i pokazać opakowanie lub etykietę

- Zastosowanie:

- substancje i preparaty, sklasyfikowane jako szkodliwe R65 zgodnie z kryteriami w pkt 3.2.3,

- niestosowany do substancji i preparatów wprowadzanych do obrotu w pojemnikach aerozolowych (lub w szczelnych pojemnikach ze spryskiwaczem), patrz ppkt 8 i 9.

- Kryteria użycia:

- obowiązkowe dla substancji i preparatów wymienionych powyżej, lub jeśli sprzedawane, prawdopodobnie mogą być używane przez ogół społeczeństwa, poza tymi gdzie S45 lub S46 są obowiązkowe,

- zalecane dla substancji i preparatów wymienionych wyżej, gdy używane w przemyśle, z wyjątkiem przypadków gdzie S45 lub S46 są obowiązkowe.

S63 W razie wypadku przez wdychanie przenieść poszkodowanego na świeże powietrze i utrzymywać w pozycji nieruchomej

- Zastosowanie:

- bardzo toksyczne i toksyczne substancje i preparaty (gazy, opary, cząstki, lotne ciecze),

- substancje i preparaty powodujące uczulenie dróg oddechowych.

- Kryteria użycia:

- obowiązkowe dla substancji i preparatów, którym przypisano R26, R23 lub R42 i które mogą być prawdopodobnie używane przez ogół społeczeństwa w sposób, który może powodować wdychanie.

S64 W razie połknięcia przepłukać usta wodą (tylko gdy osoba jest przytomna)

- Zastosowanie:

- żrące i drażniące substancje i preparaty.

- Kryteria użycia:

- zalecany dla powyższych substancji i preparatów, które prawdopodobnie mogą być używane przez ogół społeczeństwa i w przypadku, gdy powyższe traktowanie jest odpowiednie.

7. ETYKIETOWANIE

7.1. Gdy substancja lub preparat zostały sklasyfikowane, określana jest właściwa etykieta z odniesieniem do wymagań art. 23 niniejszej dyrektywy oraz art. 10 dyrektywy 1999/45/WE odpowiednio dla substancji i preparatów. Niniejszy punkt wyjaśnia, w jaki sposób określa się etykietę, w szczególności podaje wytyczne dotyczące sposobu wyboru właściwych wyrażeń zagrożenia i bezpieczeństwa.

Etykieta zawiera następujace informacje:

a) w odniesieniu do preparatów nazwa handlowa lub oznaczenie;

b) w odniesieniu do substancji nazwę substancji, a w odniesieniu do preparatów nazwy substancji obecnych w preparacie, zgodnie z regułami określonymi w art. 10 ust. 2 pkt 3 dyrektywy 1999/45/WE;

c) nazwisko lub nazwę, pełny adres i numer telefonu osoby odpowiedzialnej za wprowadzanie substancji lub preparatu do obrotu, albo producenta, importera lub dystrybutora;

d) symbol(-e) i oznaczenie(-a) niebezpieczeństwa;

e) wyrażenia oznaczające poszczególne zagrożenia (wyrażenia zagrożenia R);

f) wyrażenia wskazujące zalecenia dotyczące bezpieczeństwa (wyrażenia S);

g) w odniesieniu do substancji - numer WE, a ponadto w odniesieniu do substancji znajdujących się w załączniku I - wyraz "etykieta WE";

h) w odniesieniu do preparatów oferowanych lub sprzedawanych ogółowi społeczeństwa nominalna ilość zawartości, chyba że jest określona w jakimkolwiek innym miejscu na opakowaniu.

Uwaga:

W odniesieniu do niektórych preparatów istnieją dodatkowe wymagania w zakresie etykietowania, określone w art. 10 ust. 1 pkt 2 i w załączniku V do dyrektywy 1999/45/WE i w art. 20 dyrektywy 98/8/WE.

7.1.1. Ostateczny wybór wyrażeń zagrożenia i bezpieczeństwa

Chociaż ostateczny wybór najbardziej właściwych wyrażeń zagrożenia i bezpieczeństwa jest głównie kierowany potrzebą podania wszystkich niezbędnych informacji, należy również uwzględnić jasność i oddziaływanie etykiety. W celu przejrzystości, niezbędne informacje powinny być wyrażone minimalną ilością wyrażeń.

W przypadku substancji, które są drażniące, wysoce łatwopalne, łatwopalne i utleniające, wskazanie wyrażeń R oraz wyrażeń S nie musi być podane, w przypadku gdy opakowanie nie zawiera więcej niż 125 ml. Stosuje się to w przypadku takiej samej objętości szkodliwych substancji nie sprzedawanych ogółowi społeczeństwa.

W odniesieniu do preparatów, jesli zawartość opakowania nie przekracza 125 ml:

- jeśli sklasyfikowane jako wysoce łatwopalne, utleniające, drażniące, z wyjątkiem tych oznaczonych R41 lub niebezpiecznych dla środowiska naturalnego i oznaczonych symbolem "N", nie jest konieczne wskazanie wyrażeń R lub wyrażeń S,

- jeśli sklasyfikowane jako łatwopalne lub niebezpieczne dla środowiska naturalnego i nieoznaczone symbolem "N", konieczne jest wskazanie wyrażeń R lecz nie jest konieczne wskazanie wyrażeń S.

7.1.2. Bez uszczerbku dla art. 16 ust. 4 dyrektywy 91/414/EWG i dla dyrektywy 98/8/WE, wskazania takie jak "nietoksyczny", "nieszkodliwy", "niezanieczyszczony", "ekologiczny" lub jakiekolwiek inne oświadczenia wskazujące, że substancja lub preparat nie jest niebezpieczny lub prawdopodobnie doprowadzi do zbyt niskiego oszacowania niebezpieczeństwa danej substancji lub preparatu, nie znajduje się na etykiecie lub opakowaniu substancji albo preparatów objętych niniejszą dyrektywą lub dyrektywą 1999/45/WE.

7.2. Nazwa(-y) chemiczna(-e) występujące na etykiecie

7.2.1. W odniesieniu do substancji wymienionych w załączniku I etykieta wskazuje nazwę substancji pod jednym z oznaczeń podanych w załączniku I.

W odniesieniu do substancji niewymienionych w załączniku I nazwa jest ustalana zgodnie z międzynarodowo uznaną nomenklaturą chemiczną, jak określono w ppkt 1.4.

7.2.2. W odniesieniu do preparatów wybór nazw wskazanych na etykiecie następuje zgodnie z regułami art. 10 ust. 2 pkt 3 dyrektywy 1999/45/WE.

Uwaga:

Z zastrzeżeniem załącznika V, B.9 do dyrektywy 1999/45/WE,

- nazwa substancji uczulającej musi być wybrana zgodnie z ppkt 7.2.1 niniejszego załącznika,

- w przypadku preparatów stężonych przeznaczonych dla branży perfum:

- osoba odpowiedzialna za wprowadzanie ich do obrotu może określić zaledwie jedną substancję uczulającą, która według jej przekonania jest głównie odpowiedzialna za ryzyko uczulenia,

- w przypadku substancji naturalnej chemiczna nazwa może być typu: "rdzenny olej z...", "wyciąg z...." bardziej niż nazwy składników oleju rdzennego lub wyciągu.

7.3. Wybór symboli oznaczających niebezpieczeństwo

Wzór symboli oznaczających niebezpieczeństwo i sformułowanie wskazań niebezpieczeństwa odpowiada tym określonym w załączniku II. Symbol jest drukowany na czarno, na pomarańczowo-żółtym tle.

7.3.1. W odniesieniu do substancji znajdujących się w załączniku I symbole oznaczające niebezpieczeństwo i oznaczenia niebezpieczeństwa są tymi wskazanymi w załączniku.

7.3.2. W odniesieniu do substancji niebezpiecznych, nieznajdujących się jeszcze w załączniku I i w odniesieniu do preparatów symbole oznaczające niebezpieczeństwo i oznaczenie niebezpieczeństwa są wyznaczone zgodnie z regułami określonymi w niniejszym załączniku.

W przypadku gdy więcej niż jeden symbol oznaczający niebezpieczeństwo jest przypisany substancji lub preparatowi:

- obowiązek wskazania symbolu "E" czyni symbole "F+", "F" i "O" fakultatywnymi,

- obowiązek wskazania symbolu "T+" lub "T" czyni symbole "Xn", "Xi" i "C" fakultatywnymi,

- obowiązek wskazania symbolu "C" czyni symbole "Xn" i "Xi" fakultatywnymi,

- jeśli przypisany jest symbol "Xn" , symbol "Xi" jest fakultatywny.

7.4. Wybór wyrażeń oznaczających zagrożenie

Sformułowanie wyrażeń R zgadza się z tym określonym w załączniku III.

Połączone wyrażenia R w załączniku III są używane w odpowiednim przypadku.

7.4.1. W odniesieniu do substancji znajdujących się w załączniku I wyrażenia R są tymi wskazanymi w załączniku.

7.4.2. W odniesieniu do substancji nieznajdujących w załączniku I, wyrażenia R zostaną wybrane zgodnie z następującymi kryteriami i priorytetami:

a) w przypadku niebezpieczeństw, które wywołują skutki dla zdrowia:

i) wyrażenia R odpowiadające kategorii niebezpieczeństwa zilustrowanego symbolem muszą znajdować się na etykiecie;

ii) wyrażenia R odpowiadające innym kategoriom niebezpieczeństwa, które nie są zilustrowane symbolem na mocy art. 23;

b) w przypadku niebezpieczeństw wynikających z właściwości fizykochemicznych:

- wyrażenia R odpowiadające kategorii niebezpieczeństwa zilustrowanego symbolem muszą znajdować się na etykiecie;

c) w przypadku niebezpieczeństw dla środowiska naturalnego:

- wyrażenia R odpowiadające kategorii klasyfikacji "niebezpieczne dla środowiska naturalnego" muszą znajdować się na etykiecie.

7.4.3. W odniesieniu preparatów wyrażenia R zostaną wybrane zgodnie z następującymi kryteriami i priorytetami:

a) w przypadku niebezpieczeństw, które powodują skutki dla zdrowia:

i) wyrażenia R odpowiadające kategorii niebezpieczeństwa zilustrowanego przez symbol. W niektórych przypadkach wyrażenia R muszą być przyjęte zgodnie z tabelami części B załącznika II do dyrektywy 1999/45/WE. Bardziej szczegółowo wyrażenia R składnika(-ów), które są odpowiedzialne za przypisanie preparatowi kategorii niebezpieczeństwa, muszą znajdować się na etykiecie;

ii) wyrażenia R odpowiadające innym kategoriom niebezpieczeństwa, które zostały przypisane składnikom, ale które nie są zilustrowane symbolem na mocy art. 10 ust. 2 pkt 4 dyrektywy 1999/45/WE;

b) w przypadku niebezpieczeństw wynikających z właściwości fizykochemicznych:

- kryteria opisane w ppkt 7.4.3 lit. a) są stosowane z wyjątkiem wyrażeń R, "skrajnie łatwopalne" lub "wysoce łatwopalne" nie wymagają oznaczenia, w przypadku gdy powtarzają sformułowanie wskazania niebezpieczeństwa używanego z symbolem;

c) w przypadku niebezpieczeństw dla środowiska naturalnego:

i) wyrażenie R odpowiadające kategorii klasyfikacji "niebezpieczne dla środowiska naturalnego" muszą znajdować się na etykiecie;

ii) w przypadku gdy wyrażenie R50 zostało przypisane dodatkowo do połączonego wyrażenia R: R51/53 lub R52/53 lub tylko do jedynego wyrażenia R53, używa się połączonego wyrażenia R50/53.

Jako ogólna reguła w odniesieniu do preparatów maksimum sześć wyrażeń R wystarczy, aby opisać zagrożenie; w tym celu połączone wyrażenia wymienione w załączniku III są uznawane za pojedyncze wyrażenia. Jednakże jeśli preparat wchodzi w zakres więcej niż jednej kategorii niebezpieczeństwa, te standardowe wyrażenia obejmują wszystkie główne zagrożenia związane z preparatem. W niektórych przypadkach więcej niż sześć wyrażeń R może być konieczne.

7.5. Wyrażenia bezpieczeństwa

Sformułowanie wyrażeń S odpowiada tym ustanowionym w załączniku IV.

Połączone wyrażenia S w załączniku IV są używane w odpowiednim przypadku.

7.5.1. W odniesieniu do substancji znajdujących się w załączniku I wyrażenia S są tymi wskazanymi w załączniku. W przypadku gdy nie wskazano wyrażeń S, producent/importer może dołączyć wszelkie właściwe wyrażenia S. W odniesieniu do substancji nie będących w załączniku I i w odniesieniu do preparatów producent musi włączyć wyrażenia S zgodnie z kryteriami podanymi w rozdziale 6 niniejszego załącznika.

7.5.2. Wybór wyrażeń bezpieczeństwa

Ostateczny wybór wyrażeń bezpieczeństwa musi się odnosić do wyrażeń oznaczających zagrożenie wskazanych na etykiecie i do zamierzonego użycia substancji lub preparatu:

- jako ogólna zasada maksymalnie sześć wyrażeń S wystarcza, aby wyrazić najbardziej właściwe zalecenie dotyczące bezpieczeństwa; w tym celu połączone wyrażenia wymienione w niniejszym załączniku IV są uznawane za pojedyncze wyrażenia,

- w przypadku wyrażeń S dotyczących sprzedaży użyte jest jedno wyrażenie S, chyba że jest oczywiste, że sprzedaż materiału i jego opakowań nie stanowi niebezpieczeństwa dla zdrowia człowieka lub dla środowiska naturalnego. W szczególności zalecenie dotyczące bezpiecznej sprzedaży jest ważne w odniesieniu do substancji i preparatów sprzedawanych ogółowi społeczeństwa,

- niektóre wyrażenia R stają się zbyteczne, jeśli przeprowadzi się staranny wybór wyrażeń S i na odwrót; wyrażenia S, które w sposób oczywisty odpowiadają wyrażeniom R znajdują się na etykiecie, tylko jeśli ma to na celu podkreślenie szczególnego ostrzeżenia,

- należy zwrócić szczególną uwagę przy wyborze wyrażeń bezpieczeństwa na przewidywalne warunki użycia niektórych substancji i preparatów, np. skutków rozpylania i innych efektów aerozolowych. Wyrażenia powinny być wybierane z uwzględnieniem zamierzonego użycia,

- wyrażenia bezpieczeństwa S1, S2 i S45 są obowiązkowe w odniesieniu do bardzo toksycznych, toksycznych i żrących substancji i preparatów sprzedawanych ogółowi społeczeństwa,

- wyrażenia bezpieczeństwa S2 i S46 są obowiązkowe w odniesieniu do innych substancji i preparatów niebezpiecznych (poza tymi tylko sklasyfikowanymi jako niebezpieczne dla środowiska naturalnego) sprzedawanych ogółowi społeczeństwa.

W przypadku gdy wyrażenia wybrane zgodnie ze ścisłymi kryteriami w ppkt 6.2 powodują rozwlekłość i dwuznaczność lub są wyraźnie niepotrzebne w odniesieniu do określonego produktu/opakowania, można skreślić niektóre wyrażenia.

7.6. Numer WE

Jeżeli substancja nazwana na etykiecie jest wymieniona w Europejskim Spisie Istniejących Substancji Chemicznych o znaczeniu handlowym (EINECS) lub w Europejskim Wykazie Zgłoszonych Substancji (ELINCS), numery EINECS lub ELINCS substancji są wskazane na etykiecie. Niniejszego wymagania nie stosuje się do preparatów.

7.7. Wymiary etykiety dla preparatów

Wymiary etykiety są następujące:

Pojemność opakowania	Wymiary (w milimetrach)
- nie przekraczająca 3 l:	jeżeli to możliwe, co najmniej 52 x 74
- większa niż 3 l, ale nie przekraczająca 50 l:	co najmniej 74 × 105
- większa niż 50 l, ale nie przekraczająca 500 l:	co najmniej 105 × 148
- większa niż 500 litrów:	co najmniej 148 × 210.

Każdy symbol obejmuje przynajmniej jedną dziesiątą pola powierzchni etykiety, lecz nie mniej niż 1cm². Etykieta jest mocno przyklejona do jednej lub więcej powierzchni opakowania, niezwłocznie po napełnieniu preparatem.

Wymagane informacje na etykiecie wyraźnie odcinają się od tła i mają taki rozmiar i odstępy, aby były łatwo czytelne.

8. SZCZEGÓLNE PRZYPADKI: SUBSTANCJE

8.1. Przenośne butle do gazu

W odniesieniu do przenośnych butli do gazu wymagania dotyczące etykietowania, są uznane za spełnione, gdy są one zgodne z art. 23 lub art. 24 ust. 6 lit. b).

Jednakże w drodze odstępstwa od art. 24 ust. 1 i 2 można wykorzystać jedną z nastepujących możliwości w odniesieniu do butli do gazu o pojemności wodnej mniejszej lub równej 150 litrów:

- format i wymiary etykiety mogą spełniać zalecenia normy ISO, ISO/DP 7225 (wydanie 1994) odnoszące się do: "Butle gazowe - etykiety ostrzegajace",

- informacje określone w art. 23 ust. 2 mogą być dostarczone na trwałej płycie informacyjnej lub na etykiecie umocowanej do nakrętki butli.

8.2. Pojemniki na gaz przeznaczone dla propanu, butanu lub gazu płynnego (LPG)

Te substancje są sklasyfikowane w załączniku I. Chociaż sklasyfikowano je zgodnie z art. 2, nie przedstawiają one niebezpieczeństwa dla ludzkiego zdrowia, gdy są wprowadzone do obrotu w zamkniętych butlach wielokrotnych lub w postaci jednokrotnych wkładów w zakresie EN 417 jako paliwo gazowe, które są dopuszczone tylko do spalania (EN 417, wydanie z września 1992 r. dotyczące: "Nienapełnialne metalowe wkłady gazowe dla gazu płynnego z lub bez zaworu, dla użycia przenośnego: konstrukcja, kontrola, badanie i oznaczanie").

Te butle lub wkłady muszą być etykietowane właściwym symbolem i wyrażeniami R i S dotyczącymi palności. Nie jest wymagana na etykiecie informacja dotycząca wpływu na zdrowie ludzkie. Jednakże informacja dotycząca wpływu na ludzkie zdrowie, która powinna znajdować się na etykiecie, jest przekazana zawodowemu użytkownikowi przez osobę odpowiedzialną za wprowadzanie substancji do obrotu w formacie przewidzianym w art. 27 dyrektywy. Konsumentowi przekazuje się wystarczające informacje, aby umożliwić mu podjęcie wszelkich niezbędnych środków dotyczących zdrowia i bezpieczeństwa, jak przewidziano w art. 1 ust. 3 dyrektywy 91/155/EWG, zmienionej dyrektywą 93/112/EWG.

8.3. Metale w postaci masowej

Te substancje są sklasyfikowane w załączniku I lub są sklasyfikowane zgodnie z art. 6. Jednakże niektóre z tych substancji, chociaż sklasyfikowane zgodnie z art. 2, nie przedstawiają niebezpieczeństwa dla ludzkiego zdrowia przez wdychanie, spożycie lub kontakt ze skórą oraz dla środowiska wodnego w postaci, w jakiej są wprowadzone do obrotu. Takie substancje nie wymagają etykiety zgodnie z art. 23. Jednakże wszystkie informacje, które powinny znajdować się na etykiecie, są przekazane użytkownikowi przez osobę odpowiedzialną za wprowadzanie metalu do obrotu w formacie przewidzianym w art. 27.

8.4. Substancje sklasyfikowane za pomocą R65

Substancje sklasyfikowane jako szkodliwe na podstawie zagrożenia wdychania nie wymagają etykietowania jako szkodliwe za pomocą R65, gdy są wprowadzane do obrotu w pojemnikach aerozolowych lub w szczelnych pojemnikach z rozpylaczem.

9. SZCZEGÓLNE PRZYPADKI: PREPARATY

9.1. Preparaty gazowe (mieszaniny gazów)

W odniesieniu do preparatów gazowych należy uwzględnić:

- ocenę właściwości fizykochemicznych,

- ocenę zagrożeń dla zdrowia,

- ocenę zagrożeń dla środowiska naturalnego.

9.1.1. Ocena właściwości fizykochemicznych

9.1.1.1. Łatwopalność

Palne właściwości tych preparatów są ustalone zgodnie z art. 5 dyrektywy 1999/45/WE według metod określonych w części A załącznika V do niniejszej dyrektywy.

Preparaty te zostaną sklasyfikowane zgodnie z wynikami prowadzonych badań oraz w odniesieniu do kryteriów załącznika V i do kryteriów wytycznych dotyczących etykietowania.

Jednakże poprzez odstępstwo, w przypadku gdy preparaty gazowe są produkowane w małych ilościach, łatwopalność tych mieszanin gazowych można oszacować nastepującą metodą obliczeniową:

wyrażenie mieszaniny gazów

gdzie:	A_i i B_i	są ułamkami molowymi
	F_i	gaz łatwopalny
	I_i	gaz obojętny
	N	liczba łatwopalnych gazów
	P	liczba gazów obojętnych

może być przekształcone do postaci, gdzie wszystkie I_i (gazy obojętne) są wyrażone poprzez równoważnik azotowy, stosując współczynnik K_i i gdzie równoważna zawartość gazu niepalnego A'_i jest wyrażona, jak następuje:

A'_i = A_i × (100/(A_i + K_iB_i))

Przez użycie wartości maksymalnej zawartości gazu palnego, który w mieszaninie z azotem, daje skład niełatwopalny w powietrzu (Tci), uzyskuje się następujące wyrażenie:

Σ_i A'_i/Tci ≤ 1

Mieszanina gazu jest palna, jeśli wartość powyższego wyrażenia jest większa od jeden. Preparat jest sklasyfikowany jako skrajnie łatwołatwopalny i przypisuje mu się wyrażenie R12.

Współczynniki równoważności (K_i)

Wartości współczynników równoważności K_i, między obojętnymi gazami i azotem i wartości maksymalnej zawartości gazu palnego (Tci) można znaleźć w tabeli 1 i 2 normy ISO, ISO 10156 wydanie z dnia 15.12.1990 r. (nowe: 1996 wydanie) dotycząca "Gazy i mieszaniny gazowe - oznaczanie potencjału ogniowego i zdolności utleniającej dla wyboru otworu wylotowego zaworu butli".

Maksymalna zawartość palnego gazu (Tci)

Wartość maksymalnej zawartości palnego gazu (Tci) można znaleźć w tabeli 2 normy ISO, ISO 10156 wydanie z dnia 15.12.1990 r. (nowe wydanie: 1996) dotycząca "Gazy i mieszaniny gazowe - oznaczanie potencjału ogniowego i zdolności utleniającej dla wyboru otworu wylotowego zaworu butli".

Jeśli wartość Tci dla palnego gazu nie jest pokazana w powyższej normie, można zastosować odpowiednią dolną granicę wybuchowości (LEL). Jeśli wartość LEL nie istnieje, wartość Tci ustawia się na 1% objętościowo.

Uwagi:

- powyższe wyrażenie może być zastosowane do umożliwienia właściwego etykietowania preparatów gazowych, jednakże nie może być traktowane jako metoda zastępująca doświadczalne oznaczanie technicznych parametrów bezpieczeństwa,

- ponadto, niniejsze wyrażenie nie podaje informacji czy mieszanina zawierająca utleniające gazy może zostać bezpiecznie przygotowana. Przy ocenie palności uwzględnia tych utleniających gazów,

- powyższe wyrażenie daje wiarygodne wyniki tylko, jeśli palne gazy nie wpływają na siebie w zakresie w jakim dotyczy to ich łatwopalności. Jest to uwzględniane np. dla chlorowcowanych węglowodorów.

9.1.1.2. Właściwości utleniające

Faktem jest, że załącznik V do niniejszej dyrektywy nie zawiera metody ustalania właściwości utleniających mieszanin gazowych, zatem oceny tych właściwości dokonuje się zgodnie z nastepującą metodą oszacowania.

Zasadą metody jest porównanie potencjału utleniającego gazów w mieszaninie z potencjałem utleniającym tlenu w powietrzu. Stężenie gazów w mieszaninie jest wyrażone w procentach objętościowych.

Przyjmuje sie, że mieszanina gazu jest utleniaczem bardziej utleniającym niż powietrze, jeżeli następujący warunek jest spełniony:

Σ_ix_iC_i ≥ 21

gdzie :	x_i	jest stężeniem gazu w % obj.,
	C_i	jest współczynnikiem równoważności tlenu

W tym przypadku preparat jest sklasyfikowany jako utleniający i będzie mu przypisane wyrażenie R8.

Współczynniki równoważności między utleniającymi gazami a tlenem

Współczynniki użyte w obliczeniu dla ustalenia zdolności utleniajacej niektórych gazów w mieszaninie, odnoszące się do zdolności utleniającej tlenu w powietrzu, zamieszczone w ppkt 5.2 w normie ISO, ISO 10156 wydanie z dnia 15.12.1990 r. (nowe wydanie: 1996 r.) dotyczące "Gazy i mieszaniny gazowe - oznaczanie potencjału ogniowego i zdolności utleniającej dla wyboru otworu wylotowego zaworu butli", są następujące

O₂	1
N₂O	0,6

Gdy nie istnieje wartość współczynnika C_idla gazu w cytowanej normie, przyjmuje sie wartość współczynnika równą 40.

9.1.2. Etykietowanie

Dla przenośnych butli do gazu, wymagania dotyczące etykietowania są uznane za spełnione gdy są zgodne z art. 11 ust. 6 lit. b) dyrektywy 1999/45/WE.

Jednakże, w drodze odstępstwa od art. 11 ust. 1 i 2, w odniesieniu do butli o pojemności wodnej mniejszej lub równej 150 litrom, format i wymiary etykiety muszą spełniać zalecenia normy ISO 7225 (wydanie 1994) dotyczącej "Butle gazowe - etykiety ostrzegawcze". W tym przypadku etykieta może zawierać nazwę ogólną lub przemysłową/handlową preparatu, zapewniając, że niebezpieczne składowe substancje preparatu są wskazane na obudowie butli gazowej w sposób wyraźny i nieusuwalny.

Informacja określona w art. 10 może być dostarczona na trwałej płycie informacyjnej lub etykiecie na nakrętce pojemnika.

9.2. Pojemniki na gaz przeznaczone dla wonnego propanu, butanu lub gazu płynnego (LPG)

Propan, butan i gaz płynny są sklasyfikowane w załączniku I. Chociaż preparaty zawierajace te substancje są sklasyfikowane zgodnie z art. 5, 6 i 7 dyrektywy 1999/45/WE, nie przedstawiają one niebezpieczeństwa dla zdrowia człowieka, gdy są wprowadzone do obrotu w zamkniętych butlach wielokrotnych lub w postaci jednokrotnych wkładów w zakresie EN 417 jako paliwo gazowe, które są dopuszczone tylko do spalania (EN 417, wrzesień 1992 r. wydanie dotyczące "Nienapełnialne metalowe wkłady gazowe dla ciekłych gazów z ropy naftowej, z/lub bez zaworu, dla użycia przenośnego, konstrukcja, kontrola, testowanie i oznaczanie").

Butle lub wkłady muszą być etykietowane za pomocą właściwego symbolu i wyrażeń-R i -S dotyczącymi łatwopalności. Nie jest wymagana na etykiecie informacja dotycząca wpływu na zdrowie człowieka. Jednakże informacja dotycząca działania na zdrowie człowieka, która powinna znajdować się na etykiecie jest przekazana zawodowemu użytkownikowi przez osobę odpowiedzialną za wprowadzenie substancji do obrotu w formacie przewidzianym w art. 14 dyrektywy 1999/45/WE. Konsumentowi przekazuje się wystarczające informacje, aby umożliwić mu podjęcie wszelkich niezbędnych środków dotyczących zdrowia i bezpieczeństwa jak przewidziano w art. 1 ust. 3 dyrektywy 91/155/EWG.

9.3. Stopy, preparaty zawierające polimery, preparaty zawierające elastomery

Preparaty te są sklasyfikowane zgodnie z wymaganiami art. 5, 6 i 7 i etykietowane zgodnie z wymaganiami art. 10 dyrektywy 1999/45/WE.

Jednakże, niektóre z tych preparatów, chociaż sklasyfikowanych zgodnie z art. 6 i 7 nie przedstawia niebezpieczeństwa dla zdrowia człowieka poprzez wdychanie, spożycie lub kontakt ze skórą lub dla środowiska wodnego w postaci w której są wprowadzone do obrotu. Takie preparaty nie wymagają etykiety zgodnie z art. 10 lub zgodnie z załącznikiem V.B.9. Jednakże wszystkie informacje, które znalazłyby się na etykiecie, są przekazane zawodowemu użytkownikowi za pomocą systemu informacji w formacie przewidzianym w art. 14 wyżej wymienionej dyrektywy.

9.4. Preparaty sklasyfikowane przy pomocy R65

Preparaty sklasyfikowane jako szkodliwe na podstawie szkodliwości wdychania, nie wymagają etykietowania jako szkodliwe za pomocą R65, gdy są wprowadzone do obrotu w pojemnikach aerozolowych lub w szczelnych pojemnikach z rozpylaczem.

9.5. Organiczne nadtlenki

Organiczne nadtlenki łączą właściwości utleniacza i łatwopalnej substancji w jednej cząsteczce: gdy nadtlenek organiczny rozkłada się, część utleniająca cząsteczki reaguje egzotermicznie z palną (utlenialną) częścią. Podane w załączniku V metody dotyczące właściwości utleniających, nie mogą być zastosowane do nadtlenków organicznych.

Należy użyć następującej metody obliczeń opartej na obecności aktywnego tlenu.

Dostępna zawartość tlenu (%) w preparacie nadtlenku organicznego jest dana wzorem:

16 × Σ (n_i × c_i/m_i)

gdzie:

n_i= ilość grup nadtlenkowych na cząsteczkę nadtlenku organicznego i

c_i= masowe stężenie (%) nadtlenku organicznego i

m_i = masa molekularna nadtlenku organicznego i.

9.6. Dodatkowe wymagania w zakresie etykietowania niektórych preparatów

W odniesieniu do niektórych preparatów istnieją dodatkowe wymagania w zakresie etykietowania określone w art. 10 ust. 1 pkt 2 i w załączniku V do dyrektywy 1999/45/WE i w art. 20 dyrektywy 98/8/WE.

OŚWIADCZENIE KOMISJI

W odniesieniu do ppkt 4.1.5, w szczególności ppkt 4.1.5 akapit ostatni, Komisja stwierdza, że powinno być przewidziane zastosowanie procedury art. 28 i jest przygotowana do uprzedniego zasięgnięcia opinii właściwych ekspertów wyznaczonych przez Państwa Członkowskie i posiadających szczególne kwalifikacje w odniesieniu do rakotwórczości, mutagenności lub toksyczności dla rozrodczości.

Konsultacja ta zostanie dokonana w ramach zwykłej procedury konsultacji z krajowymi ekspertami i/lub w ramach istniejących komitetów. Ta sama procedura odnosi się do przypadku, gdy substancje już zawarte w załączniku I muszą być ponownie sklasyfikowane w odniesieniu do ich rakotwórczych i mutagennych wpływów lub toksycznego wpływu na rozrodczość.

⁽¹⁾J. R. Young, M. J. How, A. P. Walker i W. M. H. Worth (1988), "Classification as corrosive or irritant to skin of preparations containing acidic or alkaline substances, without testing on animals", Toxic. In Vitro 2(1): str. 19-26.

ZAŁĄCZNIK 7B

7. Zredukowane opakowanie testowe dla produktów pośrednich w ilościach ≥ 1 ton/rocznie

1. Definicje

Bez uszczerbku dla innego wspólnotowego prawodawstwa stosuje się następujące definicje:

- "produkt pośredni" jest substancją chemiczną wyprodukowaną wyłącznie dla i użytkowaną w chemicznym przetwarzaniu, w celu przekształcenia w inną(-e) substancję chemiczną(-e);

- "emisja" dotyczy uwalniania substancji z systemu, na przykład gdy system jest przerwany. Do celów zapewnienia maksymalnego poziomu bezpieczeństwa dla pracowników i środowiska naturalnego najwazniejszym celem jest minimalizacja emisji poprzez ścisłe odizolowanie procesu;

- "ekspozycja" dotyczy tego, co dzieje się z substancją po jej wyemitowaniu czy to do szerszego środowiska, lub tego czy substancja może być potencjalnie wdychana lub wejdzie w kontakt ze skórą członka personelu. Jeśli przewidywana jest możliwość emisji, musi być uzyskana ścisła kontrola ekspozycji poprzez właściwe techniki, uwzględniając potrzebę przyjęcia zasady ostrożności przy tych fizykochemicznych, toksykologicznych i ekotoksykologicznych właściwościach, które nie były badane i są ocenione jako niebezpieczne;

- "zintegrowany system wentylacji wyciągowej" jest systemem wentylacji wyciągowej typu zamkniętego, używanym w połączeniu z zamknięciami, osłonami, obudowami, pojemnikami itd. w celu ograniczenia środków chemicznych do wewnętrznej części zamkniętej jednostki funkcjonalnej. Wszelkie procesowe szczeliny muszą być tak małe jak to możliwe. Moc wyciągowa i prowadzenie powietrza muszą być tak zaprojektowane, aby w jednostce wyciągowej było wystarczające podciśnienie zapewniające, że wszystkie gazy, opary i powstałe pyły są w pełni przechwycone i odprowadzone. Należy zapobiec przepływowi wstecznemu wyciąganych substancji niebezpiecznych do obszaru roboczego. Oznacza to zabezpieczenie przed ucieczką niebezpiecznych substancji do obszaru roboczego z zamkniętych jednostek funkcjonalnych;

- "wysoce efektywna wentylacja wyciągowa" jest systemem wentylacji wyciągowej typu otwartego lub półotwartego, który jest zwymiarowany w taki sposób, że środki chemiczne pozostają wewnątrz obszaru zlewni. Oznacza to, że pojawienie się środków chemicznych w powietrzu miejsca pracy jest praktycznie wykluczone;

- "system efektywnej wentylacji wyciągowej" jest systemem wentylacji wyciągowej typu otwartego lub półotwartego, który jest zwymiarowany w taki sposób, że środki chemiczne pozostają wewnątrz obszaru zlewni, to jest pojawienie się środków chemicznych w powietrzu miejsca pracy jest w dużej mierze wykluczony lub spełnione jest przystawanie do sprawdzonych wartości granicznych;

- "inny system wentylacji wyciągowej" jest systemem wentylacji wyciągowej typu otwartego lub półotwartego, który jest zwymiarowany w taki sposób, że pojawienie się środków chemicznych w powietrzu miejsca pracy nie może być wykluczone;

- "niskoemisyjne postacie użycia" są to na przykład:

- opakowanie zużywalne, to jest substancja niebezpieczna jest umieszczona we właściwym opakowaniu i bez otwierania opakowania jest ona wprowadzana do układu reaktora wraz z opakowaniem,

- zmiana postaci, to jest substancja jest stosowana, na przykład w postaci pasty lub granulatu zamiast postaci proszkowej,

- wsad uniwersalny; oznacza to, że substancja niebezpieczna jest otoczona plastikową otoczką, która zapobiega bezpośredniemu kontaktowi z substancją niebezpieczną. Sama otoczka nie jest substancją niebezpieczną. Jednakże możliwe jest ścieranie się plastikowej otoczki i uwolnienie substancji niebezpiecznej,

- "bezemisyjne postacie użycia" to na przykład wsad uniwersalny bez ścierania, to jest plastikowa otoczka jest na tyle odporna na ścieranie, że nie może zajść uwolnienie substancji niebezpiecznej;

- "technicznie szczelny" jest stosowany do podzespołu, jeśli wyciek nie jest dostrzegalny w czasie trwania badania, monitorowania lub sprawdzenia na szczelność, na przykład używając środków pieniących lub sprzęt do wykrywania/wskazywania wycieku, zastosowany do konkretnego użycia. Systemy, podsystemy i elementy funkcjonalne są technicznie szczelne, jeśli wskaźnik upływu jest < 0,00.001 mbar*l*s^-1.

2. Zastosowanie zredukowanego opakowania testowego

W odniesieniu do produktu pośredniego zgłaszający może zażądać od właściwych władz udzielenia pozwolenia na zastosowanie zredukowanego opakowania testowego (RTP). To RTP przedstawia minimalny zestaw danych przeznaczony do uzyskania wstępnej oceny ryzyka dla jakiegokolwiek produktu pośredniego wprowadzonego do obrotu. Jakiekolwiek dodatkowe wyniki badań mogą być wymagane zgodnie z art. 16 ust. 1, na podstawie wyniku oceny zagrożenia.

3. Warunki dotyczące zastosowania zredukowanego opakowania testowego

Zgłaszający musi przedstawić w celu spełnienia wymagań właściwych władz, w przypadku gdy zgłoszono, że następujące warunki są spełnione:

a) substancja jest wyłącznie wytwarzana dla i zużywana w lub stosowana do przetworzenia. Monomery są wyłączone. Kiedy przetworzono substancję, przekształconą w chemicznie różne cząsteczki nie będące polimerami;

b) substancja jest ograniczona do miejsc o maksymalnej liczbie dwóch użytkowników. Na przykład, może być produkowana przez jedno przedsiębiorstwo, a następnie transportowana do jednego lub dwóch innych do przetworzenia. Należy zauważyć, że jeśli dostawa jest przeznaczona dla więcej niż dwa miejsca użytkowania, warunki dla RTP nie są nadal spełniane, a dokumentacja musi być zaktualizowana do właściwego poziomu;

c) dostawa do przedsiębiorstwa, które stosuje produkt pośredni do dalszego przetworzenia, musi być bezpośrednio od zgłaszającego, a nie przez pośrednich dostawców;

d) substancja musi być ściśle zamknięta, przy pomocy środków technicznych, poprzez cały czas jej istnienia. Obejmuje to produkcję, transport, oczyszczanie chemiczne, oczyszczanie i utrzymanie, pobieranie próbek, analizę, ładowanie i rozładowanie sprzętu/pojemników, unieszkodliwianie odpadów/oczyszczanie i składowanie. Zasadniczo właściwe postępowanie musi obejmować wszystkie elementy funkcjonalne, takie jak porty załadunku, wyposażenie rozładowania itd. albo konstrukcyjnie zamkniętego typu z zabezpieczoną szczelnością, albo typu konstrukcyjnie zamkniętego, wraz z zintegrowaną wentylacją wyciągową;

e) w przypadku gdy występuje potencjalna ekspozycja, muszą być użyte proceduralne i kontrolne technologie minimalizujące emisję i wynikłą ekspozycję;

f) w przypadku prac związanych z czyszczeniem i utrzymaniem, należy zastosować procedury, szczególne takie jak oczyszczanie i mycie, przed otwarciem lub wejściem do systemu;

g) czynności transportu będą odpowiadały wymaganiom dyrektywy Rady 94/55/WE z jej zmianami;

h) w razie wypadku, który może zdarzyć się w trakcie stosowania procedur oczyszczania, czyszczenia i utrzymania, może dojść do ekspozycji do środowiska. W każdym przypadku wykorzystuje się technologie proceduralne i/lub kontrolne w celu zminimalizowania emisji i wynikłej ekspozycji;

i) musi istnieć system zarządzania określający zadania jednostek w organizacji;

j) opakowanie substancji będzie etykietowane zgodnie z załącznikiem VI do dyrektywy 67/548/EWG i dodatkowo następującym zdaniem: "Uwaga - substancja jeszcze nie w pełni zbadana";

k) zgłaszający musi obsługiwać system zarządzania substancją i musi monitorować użytkowników (maksymalnie dwóch) w celu zapewnienia zgodności z powyższymi warunkami.

4. Dokumentacja techniczna, która ma być dostarczona w odniesieniu do zredukowanego opakowania testowego

Zgłaszający wnioskujący o RTP w odniesieniu do substancji musi dostarczyć nastepującą dokumentację techniczną właściwym władzom dla wszystkich miejsc produkcji i użytkowania:

a) oświadczenie, że zgłaszający i każdy użytkownik przyjmuje warunki wymienione w pkt. 3;

b) opisanie technicznych środków, przy których pomocy uzyskuje się ścisłe zamknięcie substancji ⁽¹⁾, włączając procedury ładowania, pobierania próbek, unieszkodliwiania i czyszczenia. Nie jest konieczne dostarczenie szczegółowych informacji dotyczących integralności każdego połączenia lub wydajności zintegrowanej wentylacji wyciągowej. Jednakże niezależnie od użytych środków dla uzyskania rygorystycznego zamknięcia procesu jest ważne, aby informacja była dostępna, a jeśli zachodzi potrzeba, sprawdzić, czy twierdzenia o uzyskaniu kontroli są prawdziwe;

c) jeśli kryteria oceny systemów zamkniętych w czasie stosowania środków chemicznych, określonych w pkt. 5 poniżej nie są spełnione, zgłaszający musi dołączyć dane oddziaływania oparte na reprezentatywnych danych monitorowania i/lub rzeczywistego modelu obliczeń, dla umożliwienia właściwym władzom podjęcia decyzji o akceptacji lub nie wniosku w sprawie RTP;

d) szczegółowy opis procesów we wszystkich miejscach włączonych do produkcji i użycia. W szczególności musi być stwierdzone, czy produkcja i/lub przetwarzane odpady są odprowadzane do utylizacji wody odpadowej, spalania cieczy lub ciał stałych i jak jest wykonywane czyszczenie i utrzymanie oprzyrządowania;

e) szczegółową ocenę możliwych emisji i możliwego oddziaływania na człowieka i środowisko naturalne w czasie trwania całego życiowego cyklu, łącznie ze szczegółami różnych reakcji chemicznych włączonych w proces i sposoby, w jaki obchodzi się z pozostałościami. W przypadku gdy emisje mogą prowadzić do ekspozycji na odziaływanie, środki którymi są one kontrolowane, muszą być opisane wystarczająco szczegółowo dla umożliwienia właściwym władzom podjęcie decyzji, czy akceptować deklarację, czy obliczać wskaźnik emisji zgodnie z Dokumentem UE o technicznych wskazówkach;

f) zmiany mogące mieć wpływ na odziaływanie na człowieka lub środowisko naturalne muszą być przedstawione z wyprzedzeniem, na przykład jakiekolwiek zmiany w elementach funkcjonalnych instalacji, nowi użytkownicy lub miejsca;

g) informacja przypisana dla RTP jest następująca:

załącznik VII.B i następujące badania z niniejszego załącznika:

– prężność pary (ppkt 3.4),

– właściwości wybuchowe (ppkt 3.11),

– temperatura samozapłonu (ppkt 3.12),

– właściwości utleniające (ppkt 3.13),

– granulometria (ppkt 3.15),

– ostra toksyczność dla daphnia (ppkt 5.1.2).

Zgłaszający musi zawrzeć także inne związane informacje dla umożliwienia właściwym władzom podjęcia właściwie wyważonej decyzji i umożliwienia właściwej kontroli u użytkownika w miejscu przetwarzania produktu pośredniego. Na przykład, jeśli dodatkowe informacje fizykochemiczne i/lub toksykologiczne, i/lub informacje o zachowaniu środowiskowym są dostępne, niniejsze informacje muszą być również dołączone. Dodatkowo zgłaszający musi dokonać przeglądu dostępnych danych o toksyczności i ekotoksyczności substancji o podobnych zależnościach strukturalnych do zgłaszanej substancji. Jeśli dane związane są dostępne, szczególnie na temat toksyczności przewlekłej i dla rozrodczości, oraz rakotwórczości, wtedy należy dostarczyć podsumowanie tych danych;

h) dane osobowe zgłaszającego, producenta i użytkowników.

5. Kryteria oceny systemów zamkniętych w czasie stosowania środków chemicznych

5.1. Użycie

Indeks oceny jest stosowany do oceny instalacji. Indeks oceny klasyfikuje stosowanie substancji i wynikający, zależny od procesu potencjał ekspozycji. Zgłaszający musi zbadać instalację lub jednostkowe urządzenia w celu ustalenia indeksu oceny. Należy ocenić każdy indywidualny element funkcjonalny.

Systemy są uważane za zamknięte, jeśli ocena wszystkich dostępnych elementów funkcjonalnych odpowiada indeksowi oceny 0,5 i tylko gdy włączone elementy funkcjonalne są typu zamkniętego o zapewnionej szczelności i/lub wyposażone w zintegrowaną wentylację wyciągową. Dodatkowo musi być wykluczony bezpośredni kontakt ze skórą.

W zbiorze przykładów stosowne funkcjonalne elementy są wskazane przez pogrubioną czcionką, symbolem 0,5.

Funkcjonalne elementy częściowo otwartego typu z wysoko efektywną wentylacją wyciągową (także oznaczone indeksem oceny 0,5 normalną czcionką) nie są traktowane jako zamknięte w myśl tych zasad.

W przypadku elementów funkcjonalnych oznaczonych indeksem oceny 1 bezpieczne przystawanie do wartości granicznej na stałej podstawie nie zawsze jest zapewnione. Takimi elementami funkcjonalnymi są:

1 - zamkniętego typu, szczelność nie zapewniona

1 - częściowo otwartego typu, ze skuteczną wyciągową wentylacją.

W przypadku elementów funkcjonalnych oznaczonych indeksami oceny 2 i 4 przystawanie do wartości granicznych nie zawsze jest zapewnione. Takimi elementami funkcjonalnymi są:

2 - częściowo otwartego typu, otwarcie zamierzone dla prostej wyciągowej wentylacji

2 - otwarte z prostą wyciągową wentylacją

4 - typu otwartego lub typu częściowo otwartego

4 - naturalnej wentylacji.

Katalog przykładów w tabeli 1 ułatwia klasyfikację elementów funkcjonalnych. Elementy funkcjonalne nie zawarte w zbiorze przykładów klasyfikuje się za pomocą wniosków wyciągniętych przez analogię. Instalacja lub jednostkowe urządzenia są wtedy klasyfikowane, używając wartości indeksu elementu funkcjonalnego, który otrzymał najwyższy indeks oceny.

5.2. Sprawdzenie

Użycie niniejszego kryterium wymaga przystawania do ustanowionych parametrów procesu, jako również przeprowadzenie sprawdzeń, cytowanych w zbiorze przykładów (np. kontrola i utrzymanie).

6. Zastosowanie zredukowanego opakowania testowego

Jeśli właściwe władze zaakceptują wniosek zgłaszającego o zastosowanie RTP, wtedy informacje z badań i/lub badań ustanowionych w ppkt 7.4 muszą być wymagane dla dokumentacji technicznej określonej w art. 7. Należy zauważyć, że dla ilości poniżej 1 tona/rok stosuje się zwykle wymagania badane załącznika VIIB/VIIC.

⁽¹⁾ Typ konstrukcyjny i warunki techniczne (np. szczelność) zamkniętych elementów funkcjonalnych wyznaczają skuteczność obudowy. Dla umożliwienia właściwym władzom podjęcia decyzji, czy wymagać rygorystyczne obudowy, czy nie, jest sprawą zasadniczą, że zgłaszający dołącza szczegóły w tej sprawie. Kroki techniczne muszą zwykle spełniać warunki "Kryteria oceny systemów zamkniętych w czasie stosowania środków chemicznych", które są włączone w przewodnik w pkt 7.5 i tabelę 1 niniejszego załącznika. Niniejsze musi być stwierdzone przez zgłaszajacego, jednakże nie jest konieczne zgłaszanie każdego typu elementu funkcjonalnego w dostarczonym opisie kroków technicznych. Jakiekolwiek odchylenie od warunków kryteriów musi być w pełni opisane i uzasadnione.

TABELA 1

Zbiór przykładów

grafika

ZAŁĄCZNIK 8A

W przypadku gdy zgodnie z postanowieniami załącznika VII.A odnoszącego się do produktów pośrednich odpowiednie właściwe władze zatwierdzą wniosek o zastosowanie zmniejszonego opakowania testowego, wymagania niniejszej sekcji zmniejsza się, jak następuje:

– gdy ilość substancji wprowadzona na rynek osiągnie 10 ton rocznie na producenta lub gdy całkowita ilość wprowadzana na rynek osiągnie 50 ton na producenta; w tym przypadku odpowiednie właściwe władze muszą żądać wszystkich badań i badań ustanowionych w punktach 3-6 załącznika VII.A (z wyjątkiem już przeprowadzonych); dodatkowo odpowiednie właściwe władze mogą zażądać badań i badań poziomu 1, związanych z organizmami wodnymi,

– gdy ilość substancji wprowadzona na rynek osiągnie 100 ton rocznie na producenta lub gdy całkowita ilość wprowadzana na rynek osiągnie 500 ton na producenta; w tym przypadku odpowiednie właściwe władze muszą zażądać badań i badań poziomu 1, związanych z toksycznością dla rozrodczości. Właściwe władze mogą zdecydować, że klasyfikacja substancji jako produktu pośredniego, kwalifikująca do użycia zredukowanego opakowania testowego, nie stanowi uzasadnionej przyczyny, aby jedno lub więcej z badań było niewłaściwych, z wyjątkiem tych związanych z toksycznością dla rozrodczości.

Zmiany w prawie

Rząd chce zmieniać obowiązujące regulacje dotyczące czynników rakotwórczych i mutagenów

Rząd przyjął we wtorek projekt zmian w Kodeksie pracy, którego celem jest nowelizacja art. 222, by dostosować polskie prawo do przepisów unijnych. Chodzi o dodanie czynników reprotoksycznych do obecnie obwiązujących regulacji dotyczących czynników rakotwórczych i mutagenów. Nowela upoważnienia ustawowego pozwoli na zmianę wydanego na jej podstawie rozporządzenia Ministra Zdrowia w sprawie substancji chemicznych, ich mieszanin, czynników lub procesów technologicznych o działaniu rakotwórczym lub mutagennym w środowisku pracy.

Grażyna J. Leśniak 16.04.2024

Bez kary za brak lekarza w karetce do końca tego roku

W ponad połowie specjalistycznych Zespołów Ratownictwa Medycznego brakuje lekarzy. Ministerstwo Zdrowia wydłuża więc po raz kolejny czas, kiedy Narodowy Fundusz Zdrowia nie będzie pobierał kar umownych w przypadku niezapewnienia lekarza w zespołach ratownictwa. Pierwotnie termin wyznaczony był na koniec czerwca tego roku.

Beata Dązbłaż 10.04.2024

Będzie zmiana ustawy o rzemiośle zgodna z oczekiwaniami środowiska

Rozszerzenie katalogu prawnie dopuszczalnej formy prowadzenia działalności gospodarczej w zakresie rzemiosła, zmiana definicji rzemiosła, dopuszczenie wykorzystywania przez przedsiębiorców, niezależnie od formy prowadzenia przez nich działalności, wszystkich kwalifikacji zawodowych w rzemiośle, wymienionych w ustawie - to tylko niektóre zmiany w ustawie o rzemiośle, jakie zamierza wprowadzić Ministerstwo Rozwoju i Technologii.

Grażyna J. Leśniak 08.04.2024

Tabletki "dzień po" bez recepty nie będzie. Jest weto prezydenta

Dostępność bez recepty jednego z hormonalnych środków antykoncepcyjnych (octan uliprystalu) - takie rozwiązanie zakładała zawetowana w piątek przez prezydenta Andrzeja Dudę nowelizacja prawa farmaceutycznego. Wiek, od którego tzw. tabletka "dzień po" byłaby dostępna bez recepty miał być określony w rozporządzeniu. Ministerstwo Zdrowia stało na stanowisku, że powinno to być 15 lat. Wątpliwości w tej kwestii miała Kancelaria Prezydenta.

Katarzyna Nocuń 29.03.2024

Małżonkowie zapłacą za 2023 rok niższy ryczałt od najmu

Najem prywatny za 2023 rok rozlicza się według nowych zasad. Jedyną formą opodatkowania jest ryczałt od przychodów ewidencjonowanych, według stawek 8,5 i 12,5 proc. Z kolei małżonkowie wynajmujący wspólną nieruchomość zapłacą stawkę 12,5 proc. dopiero po przekroczeniu progu 200 tys. zł, zamiast 100 tys. zł. Taka zmiana weszła w życie w połowie 2023 r., ale ma zastosowanie do przychodów uzyskanych za cały 2023 r.

Monika Pogroszewska 27.03.2024

Ratownik medyczny wykona USG i zrobi test na COVID

Mimo krytycznych uwag Naczelnej Rady Lekarskiej, Ministerstwo Zdrowia zmieniło rozporządzenie regulujące uprawnienia ratowników medycznych. Już wkrótce, po ukończeniu odpowiedniego kursu będą mogli wykonywać USG, przywrócono im też możliwość wykonywania testów na obecność wirusów, którą mieli w pandemii, a do listy leków, które mogą zaordynować, dodano trzy nowe preparaty. Większość zmian wejdzie w życie pod koniec marca.

Agnieszka Matłacz 12.03.2024

048-003-00-6	048-007-00-8	603-066-00-4
048-004-00-1	602-025-00-8
048-005-00-7	603-029-00-2

016-023-00-4	605-020-00-9	611-001-00-6
601-048-00-0	609-007-00-9	612-035-00-4
603-063-00-8	609-049-00-8	612-051-00-1

Identyfikator:	Dz.U.UE.L.2001.225.1
Rodzaj:	Dyrektywa
Tytuł:	Dyrektywa 2001/59/WE dostosowująca do postępu technicznego po raz dwudziesty ósmy dyrektywę Rady 67/548/EWG w sprawie zbliżenia przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych dotyczących klasyfikacji, pakowania i etykietowania substancji niebezpiecznych
Data aktu:	06/08/2001
Data ogłoszenia:	21/08/2001
Data wejścia w życie:	24/08/2001, 01/05/2004

Dyrektywa 2001/59/WE dostosowująca do postępu technicznego po raz dwudziesty ósmy dyrektywę Rady 67/548/EWG w sprawie zbliżenia przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych dotyczących klasyfikacji, pakowania i etykietowania substancji niebezpiecznych

ZAŁĄCZNIK 1A

WSTĘP DO ZAŁĄCZNIKA I

ZAŁĄCZNIK 1B

ZAŁĄCZNIK 1C

ZAŁĄCZNIK 1D

ZAŁĄCZNIK 1E

ZAŁĄCZNIK 1F

ZAŁĄCZNIK 1G

ZAŁĄCZNIK 1H

ZAŁĄCZNIK 1I

ZAŁĄCZNIK 1J

ZAŁĄCZNIK 2

ZAŁĄCZNIK 3

ZAŁĄCZNIK 4

ZAŁĄCZNIK 5A

ZAŁĄCZNIK 5B

ZAŁĄCZNIK 5C

ZAŁĄCZNIK 5D

B.26. BADANIE TOKSYCZNOŚCI PODPRZEWLEKŁEJ DROGĄ POKARMOWĄ STUDIUM TOKSYCZNOŚCI NA GRYZONIACH METODĄ POWTARZANEJ 90-DNIOWEJ DAWKI DROGĄ POKARMOWĄ

ZAŁĄCZNIK 5E

B.27. BADANIE TOKSYCZNOŚCI PODPRZEWLEKŁEJ DROGĄ POKARMOWĄ BADANIA TOKSYCZNOŚCI NA NIEGRYZONIACH METODĄ POWTARZANEJ 90-DNIOWEJ DAWKI DROGĄ POKARMOWĄ

ZAŁĄCZNIK 5F

C.14. BADANIE ROZWOJU MŁODYCH RYB

ZAŁĄCZNIK 6

ZAŁĄCZNIK 7A

ZAŁĄCZNIK 7B

7. Zredukowane opakowanie testowe dla produktów pośrednich w ilościach ≥ 1 ton/rocznie

ZAŁĄCZNIK 8A

ZAŁĄCZNIK 8B

Zmiany w prawie

Rząd chce zmieniać obowiązujące regulacje dotyczące czynników rakotwórczych i mutagenów

Bez kary za brak lekarza w karetce do końca tego roku

Będzie zmiana ustawy o rzemiośle zgodna z oczekiwaniami środowiska

Tabletki "dzień po" bez recepty nie będzie. Jest weto prezydenta

Małżonkowie zapłacą za 2023 rok niższy ryczałt od najmu

Ratownik medyczny wykona USG i zrobi test na COVID

Dz.U.UE.L.2001.225.1

Dyrektywa 2001/59/WE dostosowująca do postępu technicznego po raz dwudziesty ósmy dyrektywę Rady 67/548/EWG w sprawie zbliżenia przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych dotyczących klasyfikacji, pakowania i etykietowania substancji niebezpiecznych

ZAŁĄCZNIK 1A WSTĘP DO ZAŁĄCZNIKA I

ZAŁĄCZNIK 1B

ZAŁĄCZNIK 1C

ZAŁĄCZNIK 1D

ZAŁĄCZNIK 1E

ZAŁĄCZNIK 1F

ZAŁĄCZNIK 1G

ZAŁĄCZNIK 1H

ZAŁĄCZNIK 1I

ZAŁĄCZNIK 1J

ZAŁĄCZNIK 2

ZAŁĄCZNIK 3

ZAŁĄCZNIK 4

ZAŁĄCZNIK 5A

ZAŁĄCZNIK 5B

ZAŁĄCZNIK 5C

ZAŁĄCZNIK 5D B.26. BADANIE TOKSYCZNOŚCI PODPRZEWLEKŁEJ DROGĄ POKARMOWĄ STUDIUM TOKSYCZNOŚCI NA GRYZONIACH METODĄ POWTARZANEJ 90-DNIOWEJ DAWKI DROGĄ POKARMOWĄ

ZAŁĄCZNIK 5E B.27. BADANIE TOKSYCZNOŚCI PODPRZEWLEKŁEJ DROGĄ POKARMOWĄ BADANIA TOKSYCZNOŚCI NA NIEGRYZONIACH METODĄ POWTARZANEJ 90-DNIOWEJ DAWKI DROGĄ POKARMOWĄ

ZAŁĄCZNIK 5F C.14. BADANIE ROZWOJU MŁODYCH RYB

ZAŁĄCZNIK 6

ZAŁĄCZNIK 7A

ZAŁĄCZNIK 7B 7. Zredukowane opakowanie testowe dla produktów pośrednich w ilościach ≥ 1 ton/rocznie

ZAŁĄCZNIK 8A

ZAŁĄCZNIK 8B

Zmiany w prawie

Dz.U.UE.L.2001.225.1

ZAŁĄCZNIK 1A

WSTĘP DO ZAŁĄCZNIKA I

ZAŁĄCZNIK 5D

B.26. BADANIE TOKSYCZNOŚCI PODPRZEWLEKŁEJ DROGĄ POKARMOWĄ STUDIUM TOKSYCZNOŚCI NA GRYZONIACH METODĄ POWTARZANEJ 90-DNIOWEJ DAWKI DROGĄ POKARMOWĄ

ZAŁĄCZNIK 5E

B.27. BADANIE TOKSYCZNOŚCI PODPRZEWLEKŁEJ DROGĄ POKARMOWĄ BADANIA TOKSYCZNOŚCI NA NIEGRYZONIACH METODĄ POWTARZANEJ 90-DNIOWEJ DAWKI DROGĄ POKARMOWĄ

ZAŁĄCZNIK 5F

C.14. BADANIE ROZWOJU MŁODYCH RYB

ZAŁĄCZNIK 7B

7. Zredukowane opakowanie testowe dla produktów pośrednich w ilościach ≥ 1 ton/rocznie